[发明专利]发光特异性结合检测法

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及用于完成特异性结合检测的方法和试剂盒。更具体地说，本发明涉及特异性结合检测法，其中用发光物质，优选光蛋白(photoprotein)，水母发光蛋白作为标记。本发明的发光特异性结合检测法用于确定全血中各种分析物的存在。

背景技术描述

特异性结合检测法可用于定量和定性确定各种物质(本文统称为“分析物”)。这些物质可以是大的复合分子，如蛋白质、病毒、病毒抗原、细菌细胞、细胞表面受体、酶、激素、多糖、糖蛋白、脂蛋白等，或小的半抗原分子，如肽、一些的激素、治疗性药物、滥用药物等。

这些检测法利用了生物分子间发生的特异性结合反应。最常用的特异性结合反应即发生在抗体和抗原之间。在这种情况下，将所述特异性结合检测法称为免疫检测法。也可以使用在其他结合对之间发生的反应。例如，已将在酶与底物之间、激素与受体之间以及核酸互补链之间的相互作用用于该目的。也已将其他结合反应，如抗生物素蛋白和生物素之间和免疫球蛋白与免疫球蛋白结合蛋白(如A蛋白和G蛋白)之间的反应用于特异性结合检测。

可以以各种形式将特异性结合检测具体化。例如，所述检测可以是竞争性或夹心检测。它们可以是同源或异源的，它们可以是顺次的或同时的。在最特异性结合检测中，参与特异性结合反应的结合对中的至少一个成员被标记。所述标记提供了用于检测和定量分析反应产物的方法。放射性免疫检测使用含放射性同位素的结合对(如抗原)。在酶免疫检测中，将结合对成员之一用酶标记。这样所述酶与产生可检测信号如颜色变化的底物反应。

发光特异性结合检测可使用各种化学发光和生物发光标记。一种所述检测利用称为水母发光蛋白的光蛋白作为标记。水母发光蛋白是使水母(Aequorea victoria)产生生物发光的一种高亲和性钙离子结合蛋白。天然水母发光蛋白是由一个MW21000道尔顿的多肽链组成的光蛋白，含有各一摩尔紧密结合的腔肠动物荧光素和氧。该复合物在没有钙离子的条件下是稳定的，但在每摩尔水母发光蛋白结合3摩尔钙离子后开始光的发射。在存在钙离子的条件下，水母发光蛋白催化荧光素向氧化荧光素的氧化作用，同时发出保持约10秒的蓝光(λ_最大=469nm)。参见，Stults,N.L.等，生物化学，31,1433-42(1992)，该文献作为本文的参考文献。

可从多管水母属的组织中分离水母发光蛋白。另外，还可用重组DNA技术生产。参见Cormier,M.J.，美国专利5162227和Zenno,S等，美国专利5288623。还用重组DNA方法生产了生物发光特性改善了的脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)的修饰形式。参见Prasher,D.,美国专利5360728。本文所用术语“水母发光蛋白”包括所述光蛋白的天然和重组形式，以及在前述Prasher专利中所述的修饰形式。

可在特异性结合检测中用作标记物的其他光蛋白是已知的。所述光蛋白包括obeln、mnemiopsin、berovin、pholasin、荧光素酶和从游水母属(Pelagia)、海萤属(Cypridina)和介形类甲壳动物(ostracod)分离的光蛋白。

设计最特异性的结合检测用于分析生物液，如血液或尿，用于生物学意义的分析物。当特异性结合检测的目的是为了确定全血中一种物质的存在时，通常必须将样品预处理以除去可能干扰检测的细胞组分和血红蛋白。通常是用全血的血清组分完成特异性结合检测。或者，已经设计了在特异性结合检测前加入过滤或吸收步骤，从而使来自细胞组分和血红蛋白的干扰降到最小的全血检测。参见，如Chen,F.M.，美国专利5096809。本文中术语“血液”和“全血”可相互替换，并将其定义为指通过身体心血管通道循环的、未经过分离其组分的处理的均一液体，这些组分主要含有细胞、血浆、血清和血纤蛋白。

通常非常需要直接用全血完成特异性结合检测。直接用全血完成的检测只需要较少的样品，因此避免了因预处理步骤而引起样品损失。此外，如果取消预处理步骤，就可使完成检测所需的时间最短。在急诊室和手术室环境，特别是涉及儿科患者的情况下，这些因素是特别重要的。

发明综述