[发明专利]HSV－1病毒载体系统及构建和快速导入方法

权利要求书

1、一种HSV-1病毒载体系统，用于Alzheimer氏病的基因治疗，其特征是：单纯疱疹病毒-I型(Herpes Simplex Virus Type I，HSV-1)载体系统表达式：

它含有缺陷型单纯疱疹病毒HSV-1的启动子IE、外源目的基因NGF、SV40、PolyA位点和HSV1包装点as，其特征是目的基因NGF的功能片段cDNA在BamH1酶切位点上，形成HSV-1病毒载体系统。

性质：对宿主神经细胞具有高度特异性，特别是对有丝分裂后的神经元细胞具有高度亲嗜性。

2、一种HSV-1病毒载体系统的构建方法，包括利用生物工程产品的目的基因NGF基因、缺陷型病毒、内切酶、连接酶、应用分子生物学的基因重组技术和缺失变异包装技术，其特征是将外源性目的基因神经生长因子基因的cDNA功能片段克隆在缺陷型病毒的内切酶BamH1的酶切位点上，构建成HSV-1病毒载体系统；构建好的质粒经过转化、扩增后，用溶菌酶SDS裂解细菌，酚氯仿提取DNA、乙醇沉淀、TE溶解DNA，通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法，45000rpm18小时，提纯质粒DNA。

3、根据权利要求2所述的HSV-1病毒载体系统的构建方法，其特征是所采用的缺失变异包装技术对构建的质粒进行转染和对载体病毒进行包装：以1pfu/ml的HSV-1 17tsk辅助病毒感染Vero细胞，在37℃中吸附1小时，弃去病毒液，用无血清的1640培养液洗三遍，加2ml无血清培养液，将预先准备好的脂质体DNA复合物逐渐加到培养液中混匀，置31℃中培养三天，收获的病毒为包装有病毒外膜的载体病毒；用空斑形成实验测定病毒滴度为10⁷pfu/ml。

4、一种使构建的HSV-1病毒载体系统用于临床的快速导入方法，其特征是利用病毒对神经细胞具有亲嗜性的特性，选择嗅神经作为该病毒载体的导入通道；将获得的高滴度HSV-1病毒载体0.1ml，滴度10⁶pfu/Ml，从患者鼻腔注入，该载体能迅速进入Alzheimer氏病的病变部位，通过外源目的基因产物NGF对病变神经元功能的降低或丧失起到赋活的作用，从而达到对Alzheimer氏病基因治疗的目的。