[发明专利]转人实体瘤内皮抑制因子基因双歧杆菌的方法

说明书

本发明属于基因工程制药领域。

人实体瘤临床治疗方法目前有多种多样，如手术、化疗、放疗、免疫疗法等等，绝大部分是针对肿瘤细胞进行治疗，用抑制剂或阻断剂来阻断或抑制实体瘤血管再生及血液供应方面的抗肿瘤血管生成疗法应用较少。其中1998年3月25日公开的公开号CN1177005，发明名称“一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用”发明专利，主要涉及抗肿瘤血管生成疗法。

本发明的目的改变重组人实体瘤血管的内皮抑制因子(HumanEndostatin，以下简称Endostatin)在大肠杆菌中表达纯化得到的针剂剂型方法，改为通过温控质粒pBV220(见文献1：基因工程实验技术(第二版)彭秀玲等编著，1997年2月湖南科技出版社出版)和通过转基因转化方法把人Endostatin基因导入到人体中既不产生内毒素又不产生外毒素的有益生理菌--双歧杆菌，从而制备成转Endostatin基因双歧杆菌口服制剂，或从中提纯获得重组人Endostatin作为针剂，作为一种抗血管生成疗法用于治疗人实体瘤。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

本发明的方法是以含Endostatin外源人基因为例的具有原核表达元件的温控质粒pBV220为转化载体，以双歧杆菌为受体，采用溶菌酶处理的PEG法和氯化钙法质粒载体转化方法进行转化处理，再将经转化处理后的双歧杆菌经继代选择性培养，从而获得转Endostatin基因双歧杆菌。

本发明方法一般包括以下步骤：

(1)将专利申请号为97107112．8中的人Endostatin基因通过酶切克隆入pBV220载体中，对携带有人Endostatin基因的pBV220质粒按常规方法进行扩增、提取和纯化；

(2)将双歧杆菌在常规双歧杆菌培养液中培养至对数生长期，然后用1mg／ml-3mg／ml的溶菌酶37℃处理0．5-3小时，制备成能接受外源基因的双歧杆菌受体；

(3)采用适合于原核表达元件的常规转化方法，例如PEG法和氯化钙法，用带有人Endostatin基因的pBV220质粒对双歧杆菌受体进行转化处理；

(4)将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌扩增培养后涂布于含青霉素的常规双歧杆菌培养基平板上厌氧培养48-72小时，然后挑取单一菌落于常规双歧杆菌液体培养剂内培养，再接种于涂布含青霉素的培养基平板上厌氧培养48-72小时，然后再挑取单一菌落于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代，可用于大规模液体接种扩增培养，用常规温控质粒表达方法制备成转人Endostatin基因双歧杆菌口服制剂，或按专利申请号97107112．8中重组人Endostatin提取纯化方法，从经表达处理的转Endostatin基因双歧杆菌中提取纯化得到重组人针剂。

本方法利用pBV220转化载体(含人Endostatin基因的质粒)所含的抗青霉素基因，通过在培养基中加入青霉素成为选择性培养基，在这种培养基上对经转基因转化处理的双歧杆菌进行选择性培养，已转化含有人Endostatin基因的pBV220质粒的双歧杆菌则因含有抗青霉素基因而可以正常生长形成菌落，而未转化的双歧杆菌无抗青霉素的抗性基因，对青霉素极其敏感，因而不能生长而死亡。通过对转基因双歧杆菌进行提取质粒，琼脂糖DNA电泳、内切酶酶切、表达后SDS凝胶电泳等从分子水平上鉴定转人Endostatin基因双歧杆菌，结果表明，采用本发明方法转基因双歧杆菌具有较好的稳定性和重复性。并且最终口服剂型仍可用10μg／ml青霉素抑制转基因双歧杆菌的生长，使之在体内不产生抗青霉素抗药性。所以本发明方法转基因双歧杆菌具有很好的安全性。

本发明方法适合于双歧杆菌的各种属。