[发明专利]外源基因整合动物胚胎的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及在转基因动物研究工作中，检测移植前动物胚胎细胞基因组内整合外源基因的方法。

背景技术

转基因动物技术是研究基因功能的一种重要途径；它还可以用于改造动物性状、研制人类疾病动物模型等。近年，以哺乳动物乳腺生物反应器为目的的转基因家畜研究更是吸引了众多科学家。哺乳动物乳腺生物反应器的经济潜能不可估量。

转基因动物研究面临的最大困难是工作效率低下。这在转基因家畜研制中更是如此。以转基因羊为例，外源基因显微注射入羊胚胎后，外源基因的整合率为0.2～0.5％。如果将所有成活的注射胚胎全部移植，势必要求提供大量的受体母羊，显然将造成人力、物力、财力的极大浪费。因而鉴定动物胚胎，选择有外源基因整合的胚胎(整合胚)进行移植是势在必行的事。

整合胚鉴定首先要求从完整胚胎内取出适量细胞，同时取细胞时要求对胚胎的损伤尽可能小，以保证部分细胞取出后，胚胎仍能成活，用于移植。经典的胚胎取细胞方法是显微切割法。但该方法破坏了胚胎透明带的完整性，可能造成取细胞后的胚胎碎裂。另一种方法是通过将显微注射针刺入胚胎内，用负压吸取细胞。该方法由于使用负压操作，可能造成取细胞后的胚胎负压损伤。

由于可用于鉴定的胚胎细胞数目有限，同时从整合胚的鉴定到胚胎移植仅有1～2天的时间，因而整合胚的鉴定必须要求快速、灵敏、准确。目前，聚合酶链式反应(PCR)是国内外最常用的检测方法。将取出细胞的DNA用作PCR反应的模板，用于整合胚的鉴定。单个细胞或数个细胞由于模板量太低，以单次PCR技术作为整合胚检测手段时，常常采用扩大PCR循环周期数，以期获得足够的扩增产物。但是，PCR循环数越大，非特异性DNA同时被扩增的几率越大，将严重影响对PCR结果的判定。同时，由于注射进入动物胚胎的外源基因在部分胚胎内以整合形式存在于基因组，在其它胚胎内则可能以游离、未整合状态存在。因而，以PCR扩增方法用于整合胚鉴定时，要尽量排除未整合的外源基因对结果判定的影响。有文献报道以甲基化修饰外源基因，然后用甲基化敏感的甲基化酶酶解未整合基因(参见WO-A-9222657，1992年)，这种方法要求甲基化酶酶解活力高，酶解完全。即使这样，该方法也嫌繁琐、不实用。还有报道通过胚胎细胞固定、洗涤方法，以降低未整合外源基因(参见WO-A-9314376，1995年)虽然简单，但影响因素较多。

发明内容

为此，本发明的目的是提供一种外源基因整合动物胚胎的检测方法，该方法包括先采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分胚胎细胞，然后采用巢式PCR技术检测转基因动物胚胎细胞内外源基因的整合。该方法快速、灵敏、准确性高。

本发明外源基因整合动物胚胎的检测方法，包括先采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分细胞，然后采用巢式聚合酶链式反应(PCR)技术检测胚胎内整合的外源基因，即通过二次PCR扩增外源基因。在整合胚检测时，第一次PCR扩增加入的第一对引物，位于待检测外源目的基因的最外侧或其附近区域，第二次扩增加入的第二对引物位于第一对引物的内侧，同时设置多组阳性重复试验，并加入内对照基因的引物，以降低未整合的外源基因及有时由于PCR技术本身的错误对检测结果判定的影响，提高转基因整合胚检测的准确性。

显微注射进入受精卵的外源DNA是一个固定量。随着注射受精卵发育、细胞分裂数增加，每个胚胎细胞内的未整合外源基因将成倍地降低。因而本发明取桑椹期和囊胚期的动物胚胎作为检测对象。采用“打洞压迫法”从动物胚胎中取出部分胚胎细胞。该方法取出的细胞数可达4～20个。该方法适用于从任何胎生动物胚胎内取出部分细胞。与经典的切割法不同，该方法取样后不破坏胚胎透明带的完整性，使得取细胞后的胚胎保持良好的生长能力。该方法与显微注射针负压取样法也不同，由于使用正压，压迫胚胎取细胞时，胚胎上的洞口能释放胚胎内多余压力，到达内外压平衡，故胚胎取样后损伤小，胚胎成活率达90％。

为了克服一般PCR技术检测整合胚存在的缺点，本发明采用巢式PCR技术检测整合胚，用两次PCR扩增外源目的基因。