[发明专利]甲醇毕赤酵母的转化

说明书

发明背景

甲基营养型酵母是那些能够利用甲醇作为唯一碳源和能量源的酵母。具有甲醇利用所必需的生化途径的酵母物种可分成四个属：汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属以及球拟酵母属。这些酵母属多少有点是基于细胞形态学和生长特点而人工合成的，并且不反映密切的遗传关系(Billon-Grand,Mycotaxon 35:201-204,1989;Kurtzman,Mycologia 84:72-76,1992)。此外。并非这些属中的所有物种都能够利用甲醇作为碳源和能量源。这一分类的结果是：在一属的单个物种之间的生理和代谢方面有极大的差异。

甲基营养型酵母是在重组蛋白质产生系统中利用的具有吸引力的候选者。一些甲基营养型酵母已经显示出在基本确定成分培养基上能快速生长至高生物量的特征。甲基营养型酵母的某些基因在诱导或者脱阻抑条件下得到严格调节和高度表达，这表明这些基因的启动子对于产生商业价值的多肽来说是有用的。参见，例如，Faber等，酵母，11:1331,1995；Romanos等，酵母，8:423,1992；以及Cregg等，生物/技术，11:905,1993。

在重组产生系统中用作为宿主的甲基营养型酵母的发展是缓慢的，其部分原因是由于缺乏合适的材料(例如启动子、选择性标记以及突变体宿主细胞)和方法(如转化技术)。大多数高度发展的甲基营养型宿主系统利用巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母(Faber等，Curr.Genet.25:305-310,1994；Cregg等，同上；Romanos等，同上；美国专利号4,855,242；美国专利号4,857,467；美国专利号4,879,231以及美国专利号4,929,555)。

本领域仍然需要转化甲基营养型酵母的其它物种的方法，以及需要利用所转化的细胞来产生具有经济重要性的多肽，包括工业酶和药物蛋白质。本发明提供了在这些过程中有用的组合物和方法以及其它的相关优点。

发明概要

本发明提供了将DNA分子导入甲醇毕赤酵母细胞的方法和按照这些方法转化的细胞。

在本发明的一个方面中，所说的方法包括在线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞暴露于呈指数衰变的，场强为2.5～4.5kV/cm且时间常数为1～40毫秒的脉冲电场中，由此将DNA分子导入细胞。在本发明的一个实施方案中，DNA分子包括编码一种多肽的节段，所说的多肽不是甲醇毕赤酵母多肽，可操作地连接到甲醇毕赤酵母基因转录启动子和甲醇毕赤酵母基因转录终止子上。在优选的实施方案中，转录启动子是甲醇毕赤酵母AUG1基因启动子，在一个实施方案中，该启动子包含如SEQ ID NO:2中所示的核苷酸24至核苷酸1354的核苷酸序列。该DNA分子可进一步包含补充宿主细胞中的突变的选择性标记基因。在一个实施方案中，选择性标记基因是甲醇毕赤酵母基因，如甲醇毕赤酵母ADE2基因。

在本发明的第二个方面中，提供了用异源DNA转化甲醇毕赤酵母的方法，该方法包括在异源线性DNA分子的存在下，使甲醇毕赤酵母细胞的群体暴露于呈指数衰变的，场强为2.5～4.5kV/cm且时间常数为1-40毫秒的脉冲电场中，由此将异源DNA导入至少一部分群体中，回收DNA已导入其中的细胞。在本发明的一个实施方案中，每毫克异源DNA回收10³～10⁵个细胞。在另一个实施方案中，每毫克异源DNA回收0.9×10⁴～1.1×10⁴个细胞。在进一步的实施方案中，该方法还包括从回收的细胞回收整合转化体的步骤，如通过在以山梨糖醇作为碳源的生长培养基中培养细胞。在附加的实施方案中，细胞群体处于早期对数期生长。

在其它方面中，本发明提供了用以上公开的方法转化的甲醇毕赤酵母细胞。

一旦参考下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将变得明显。

附图简要描述

图1说明电场强度和脉冲持续时间对甲醇毕赤酵母的电穿孔效率的影响。

图2是在质粒pCZR140和甲醇毕赤酵母基因组DNA之间的重组过程的示意图。

图3是质粒pCZR137和甲醇毕赤酵母基因组DNA之间的重组过程的示意图。

发明详细描述

在更详细地阐明本发明之前，先定义在本文中使用的某些术语是有用的：

＂早期对数期生长＂是在培养中的细胞生长期，其时的细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml至8×10⁶个细胞/ml。