[发明专利]经纯化的蛋白质、重组DNA序列以及控制咖啡植物成熟的方法

说明书

发明领域

本发明涉及经纯化的蛋白质、重组DNA序列、转化了该序列的宿主，以及控制咖啡植物成熟的方法。更具体地说，本发明涉及纯化蛋白质和可用于抑制咖啡果特异性1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶和ACC氧化酶基因表达的重组DNA序列。本申请进一步涉及用这样的序列转化从而不能合成出成熟所需的乙烯的咖啡植物。将外源乙烯施用于按照本发明转化的植物有可能同步化和控制咖啡植物的果实成熟。

发明背景

咖啡是从咖啡属植物，通常是小果咖啡种的烘焙咖啡豆中制备的。咖啡豆是咖啡植物的种子，可通过加工果实，最理想的是成熟果实而得到，成熟咖啡果由于其高质量而可获得最好的价格。过去是通过手工挑选出高质量的“gourmet”咖啡。由于咖啡树上的果实不是同时成熟，因而同一棵树上既有成熟咖啡果，也有未成熟的咖啡果；所以这一项工作是必需的。过去，这并不是一个严重问题，因为大多数咖啡生长于世界上劳动力比较丰富且不昂贵的地区。然而，近年来，缺乏大量且廉价的劳动力已是造成咖啡产业中生产能力萎缩的一个主要因素。为了提高生产能力，世界上有些地区，比如最大的咖啡生产国巴西，已开始求助于露天采摘收获，其中工人们从一根树枝上快速摘下所有果实，不管它已经成熟还是尚未成熟。这提高了收获的速度，但由于好大一部分果实尚未成熟(青果)，因而降低了最高质量咖啡豆的产率。

此外，果实成熟的不同步大大限制了机械性收获的有效性。从树上采摘成熟果实(浆果)所需的力与采摘青果的力相似，因此，机械收获员们不能很好区分青果和浆果，大量的未成熟果实就与成熟果实一道被摘了下来。这大大降低了成熟果实的产率，并限制了生产能力。若能控制咖啡果的成熟，使所有果实均在同一时间成熟，则手工收获的采摘方法和机械性收获的效率均可大大提高，并且，已收获的果实中更高质量级别的果实百分比将更高一些。这可提高咖啡生产的效益。

与其它许多果实一样[Yang和Hoffman，植物生理学年鉴，35:155(1984)]，植物产生的乙烯在咖啡果成熟的最后阶段具有重要的作用。一旦咖啡果发育到成熟的某一阶段，则通过外源施用乙烯可诱导它们成熟[Crisosto,C.H.,P.C.Tausend,M.A.Nagao,L.H.Fuchigami和T.H.H.Chen,J.Haw.Pac.Agri.3:13-17(1991)]。这证实了乙烯在咖啡果成熟最后阶段的重要性。

乙烯是从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)经两步反应而合成的。第一步是通过ACC合成酶从SAM合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。在大多数植物中，这正是限速步骤。最后一步是被ACC氧化酶催化的由ACC转变为乙烯(Yang和Hoffman，出处同前)。通过化学(如银离子或二氧化碳)或生物技术途径[Oeller等，科学，254:437(1991)]抑制乙烯生物合成可抑制成熟的最后阶段。通过加入乙烯，这一抑制可被逆转。

相应地，控制咖啡植物成熟的一个策略是阻止乙烯生物合成途径中特异性酶的合成。本发明一个实施方案涉及咖啡植物的基因改变以消除ACC合成酶的合成；在另一个实施方案中，ACC氧化酶的合成受到了抑制。在优选的实施方案中，抑制这两种酶之一或二者的合成是通过用一种DNA序列转化咖啡植物而达到的，所说的DNA序列可编码一种信使RNA(mRNA)的转录，该mRNA是编码表达待抑制其合成的酶类的mRNA之反义物。参见Oeller等，科学，254:437(1991)，其中报道了利用相似策略控制西红柿的成熟。

已有一些人利用重组DNA技术分离了一些ACC合成酶和ACC氧化酶基因。然而，迄今仍未鉴定出咖啡内ACC合成酶和ACC氧化酶基因或测出它们的序列。

发明简述

已纯化的蛋白质，编码其表达的DNA序列，重组DNA分子，包括用其转化的宿主，用来转化咖啡植物以抑制乙烯合成所需酶类的表达。所说的DNA序列和重组DNA分子的特征在于它们编码表达ACC合成酶或ACC氧化酶，这两种酶是咖啡植物中乙烯生物合成途径的要素。

用含有ACC合成酶和/或ACC氧化酶DNA序列的载体转化咖啡植物，所说的DNA序列在载体中的插入方式使其编码表达的相应RNA是ACC合成酶和/或ACC氧化酶的mRNA的反义物。所产生的反义RNA与mRNA结合，从而使编码乙烯合成途径中一种或多种酶的mRNA失活。也可利用所叙述的DNA序列通过共抑制(co-suppression)阻断ACC合成酶或ACC氧化酶的合成。任一事件的结果均是已转化的植物不能合成乙烯，尽管它们的代谢的其它方面并未受到影响。