[发明专利]用于生产单性果实和蔬菜的转基因方法和组合物

说明书

发明领域

总的来说，本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及转基因植物，种子，和已经进行遗传修饰以产生越过受精的需要并且启动着果的植物的组织，其在各种各样生长条件下将会产生无籽果实和蔬菜。

发明背景

对于被子植物，果实是从包围正在发育的种子的囊果皮发育的。果实的发育出现在授粉和受精之后，其结果产生胚。基于雄性配子与其他细胞在原卵中的融合，启动胚乳，随着原生质体胚的增殖同时发育。由于原卵发育为种子，子房扩展到果实。在非无性(nonapomicytic)种中通常果实的发育受原卵受精的激发，并且如果不出现授粉或受精，那么会发生花脱落并且不着果的情况。

着果也受外部因素例如温度的变动，水的可得性，光条件的抑制。例如胡椒对温度变动非常敏感。在夜间温度低于50°F或白天温度高于80°F将会导致在授粉之后不着果。较小的变化将会导致参差不齐的着果，导致产生异常形状的水果。在植物中控制着果启动的能力可以避免这些问题，因为着果可以受内部控制，而不管外部因素如何，从而提高了产量以及潜在的生长面积。这样的控制也使在没有授粉的情况下进行着果，即生产单性结实表现型。这可以使植物不管外部因素如何都可以发育果实，并且可以不管授粉与否可以发育果实。单性结实表现型常常不仅允许在没有授粉的条件下着果，而且由于没有授粉，使种子发育降低到最小或完全被抑制，提供了单性结实的第二个益处。

长期以来无籽果实和蔬菜是本领域内生产者追求的目标。所述植物的益处包括消费者对易于生产和消费所述产品的强力呼声。其他的益处包括由于没有种子腔或种子腔大大减少，果实或蔬菜更甜，肉质更厚，可食部分增加。通常由于局部使用激素或使用高度复杂的育种程序导致产生三倍体基因型，在本领域内已经显示了几个优点。

长期以来局部使用赤霉素用于诱导葡萄的无籽(单性结实)表现型。该方法通常需要喷涂程序，因此，该方法是麻烦的，依赖于气候的，并且必须正确地控制时间，以便在授粉之后立即出现。

另一种方法需要复杂的育种程序用于生产无籽西瓜。西瓜的无籽状态几乎总是每个细胞存在三种同源补体，而不是通常的两个的结果，已知为三倍体。这些西瓜在正常地发育为胚时出现了问题，并且导致在三倍体植物中不存在种子。异常胚的形成导致在早期阶段正常的原卵停止发育为种子。通常，无籽西瓜含有类似于未成熟黄瓜的、小的、可食用的白色原卵。

世界专利WO91/09957已公开了制备无籽果实的转基因方法。该方法涉及称之为“CRE-LOX”的高度复杂的重组切除系统，通常CRE的基因产物产生了蛋白质重组酶，该酶在特定的LOX DNA序列中起作用。公开了几种重组功能与被切除的LOX DNA序列最一致。在该申请中假设无籽西瓜出现在涉及用来自于解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的基因转化的状态。通常，雌性植株具有种子外壳特异性启动子(SC).CRE.终止子，雄性植株具有SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因::lox::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子。当繁殖时两个亲本没有表现型的变化，并且在种子生产领域内雌性种子亲本基因正常的种子座，因为两个基因在同一时间不发挥功能(种子外壳仅是母本的组织)。但是，在F1代母本组织将会含有两个基因。在该构型中，种子外壳的构成(F1植株，F2种子)是SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因::-::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子，其中::-::表示lox基因被切除的点，产生了特异于种子外壳的功能性毒素基因。在理论上，如果种子外壳破碎了，种子的发育将被抑制，因为营养物不能流到胚中。

至今没有公开试验数据并且没有人证明所建议的方案成功地发育为实际的无籽西瓜。

因此，从以上可以看到本领域内需要用于生产单性果实和蔬菜的方案，该方法应该是简单的，易做的和易于重复的。

本发明的目的之一是提供了表达构建体，当在转基因植物中表达时，导致在没有授粉时产生着果并且也导致产生无籽果实和蔬菜。

本发明的另一个目的是提供了能够回交的自交亲本系，导致产生单性结实的F1植株杂交，并且将不会产生种子或大量种子显著降低。

本发明的又一目的是提供了含有本发明的表达构建体的植物，植物细胞和植物组织。

本发明的还有一个目的是提供了用于转化植物细胞的载体包括病毒或质粒载体，以及掺入了本发明的基因和启动子的表达盒。

本发明的再一个目的是提供了包括用于维持复制和植物转化的所述载体的细菌细胞。

根据下面的描述，本发明的其他目的是显而易见的。

发明概述