[发明专利]用于改进酵母中的多肽生产的表达载体

说明书

本发明涉及用于在酵母中生产多肽的新的表达载体，被该载体转化的酵母菌株，产生所述载体、所述酵母菌株和所述多肽的方法。

在用于在酵母中表达的基因工程技术中常用穿梭载体，该载体含有编码特定多肽的核苷酸序列以及在酵母中进行所述表达所必需的序列，如酵母启动子。该穿梭载体还含有允许在细菌(例如通常为大肠杆菌)或其它微生物中表达的序列。这种另外的非酵母序列仅对构建载体有用。然而，它们对于在酵母中的表达是多余的。实际上，它们可妨碍多肽在酵母中的有效表达或延缓生物的复制，因为多余的核苷酸也一定会加倍，这是一个消耗能量的过程。

因其遗传系统众所周知、生长快速以及操作上的技术优势，通常将酿酒酵母用作生产同源和异源蛋白质的极好微生物。另外，用于导入克隆基因并在简单的发酵条件下便宜并安全地过量生产的DNA转化系统的进展使得酿酒酵母在大规模的工业实践中特别有用。

大量酵母多肽是本领域中已知的。其中特别有意义的是超氧化物歧化酶。酿酒酵母含有两种类型的超氧化物歧化酶(EC1.15.11)：一种含铜/锌-(Cu/Zn SOD)，一种含锰-(Mn SOD)。前一种(Cu/Zn SOD)位于胞质中，而含锰酶局限于线粒体基质中。据称该酶可提供抗细胞内产生的游离毒性基团如正常代谢的中间体的体内保护作用(Bilinski，T.等，生物化学生物物理研究通讯，130：533-539(1985)，Van Loon A.P.G.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3820-3824(1986)，Lee F.J.等，游离基生物医学杂志，1：319-325(1985)，Galiazzo F.等，Biochim.Biophys.Acta 965：46-51(1988))。因此，超氧化物歧化酶有望被用于预防或治疗潜在的人体损害，尤其是因细胞老化和衰老引起的损害(Rosen D.R.等，自然362，59-62(1993)，McCord J.M.和Fridovich I.生物化学杂志244：6049-6055(1969)，McCord J.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 68：1024-1027(1971)。McCord J.M.新英格兰医学杂志，312：159-163(1985))。

已对酿酒酵母的Cu/Zn SOD基因进行了克隆和测序(Berming-ham-McDonogh O.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4789-4793(1988))，并深入透彻地鉴定了该酶的结构和作用机制(DjinovicK.等，分子生物学杂志，225：791-809(1992)，O’Neill P.等，生物化学杂志，251：41-46(1988))。Cu/Zn SOD是大多数需氧和很多厌氧生物的胞质中大量存在的金属酶，其活性催化超氧化物阴离子歧化为分子氧和过氧化氢。

本发明的目的是使经编码多肽的表达载体转化的酵母的发酵过程中的多肽产量增加。本发明的另一目的是提供能在酵母中表达所需多肽的新载体，其中相对于以前使用的方法而言，表达量有所增加。本发明的另一目的是被该载体转化的新的酵母菌株，与野生型相比所述菌株是优良菌株，或者是被穿梭载体转化的酵母菌株。

本发明提供了表达载体以及被该载体转化的酵母菌株，尤其是酿酒酵母菌株，与野生型或被穿梭载体转化的菌株相比，所述菌株可产生较高水平的酵母或非酵母多肽，例如酶，如Cu/Zn超氧化物歧化酶。本发明还描述了制备这种表达载体、酵母菌株和内源性酵母多肽的方法。

通过参照详细描述和具体阐明本发明实际操作的本发明附图，本领域技术人员不难看出本发明的多个方面和优点。

本发明中使用了下列引物DNA序列，其精确结构示于序列表中(引物的bp区取自EMBL载体，Gene Bank登记号为J03279)：SEQ ID NO：1是外部引物SOD-3，上游区域81-102bp。SEQ ID NO：2是外部引物SOD-2，下游区域1018-1036bp。SEQ ID NO：3是内部引物SOD-4，区域971-991bp。

以下是附图简述，旨在使本发明更易于被理解。

图1概述了酵母菌株S288C的Cu/Zn SOD基因的编码区，在SOD基因座的上游和下游区域设计了外部引物SOD3和SOD2以及内部引物SOD4的位置。