[发明专利]登革病毒基因表达的方法

说明书

技术分支

本发明属于生物技术领域并涉及重组DNA技术，具体地，涉及在毕赤酵母属甲基营养酵母中表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。

现有技术

技术目的是使用称为MP-36的巴斯德毕氏酵母菌株BMK90的自养型突变株his3(欧洲专利申请EP43 8200)作为宿主来开发有效表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的系统以得到用于人类接种的免疫原。

开发重组疫苗主要关心的是得到此病毒包膜蛋白的适当集合体，并且所用表达系统是此问题的最重要方面(Mason P W，Mc Ada P C，Dalrymple JM，Fournier M J y Mason T L，大肠杆菌中日本脑炎病毒抗原的表达，病毒学，1987；158：361)。

为此目的，已实施了几种表达系统以生产此黄病毒的不同重组蛋白，包括结构和非结构蛋白如C-prM-DE-NS1-NS2A-NS2B(Tolou H，Pisano MR，Deubel V y Nicloe J.Problemes et perspectives en matiere devaccination contre les Flavivirus.bull Inst Pasteur 1992；90：11-29；Zhang Y M，Hayes E P，Mc Carthy T C y col.用杆状病毒重组体表达的登革病毒结构蛋白和非结构蛋白NS1免疫小鼠诱导对登革病毒脑炎的抗性，病毒学杂志1988；62：3027-3031)。为选择适当的系统因素如重组产物表达和加工的可能性、翻译后修饰、糖基化作用、蛋白水解、分泌至培养基、保留二级结构的能力以获得与天然产物相似的产品。考虑系统提供抗原产品的百分比即产量是很重要的。

用于重组黄病毒蛋白表达的第一个表达系统是细菌，特别是大杆菌。这些蛋白表达容易并且达到高产量(细胞总蛋白的10～20％)，但是这种表达系统有一些局限性。主要问题是几种重组蛋白以活性不溶形式聚积形成内含体。使这样的蛋白恢复的必需的变性和重折叠技术昂贵并且复杂(Marston FAO，大肠杆菌中表达的真核动物多肽的纯化，生物化学杂志1986；240：1-12)。当表达小分子肽时出现另一困难，肽迅速降解并且以融合蛋白合成，必须在体外进行包括另一套纯化的后切割(Itakura等，1978)。然而不能进行重组产物的翻译后加工是主要的限制。虽然已认为与其它不同表达系统相比，这些蛋白作为免疫原不是非常有用的，但是一些表达蛋白表现诱导中和抗体(ACS)的同种型(Mason P W，Zogel MV，Semproni A R，Fournier MJ y Mason T L.大肠杆菌中表达的1型登革病毒包膜和NS1蛋白的抗原结构，J Gen Virol.，1990；71：2107-2114)。

昆虫细胞是获得几个病毒来源基因(包括需要蛋白水解加工、糖基化作用或分泌作用的那些基因)高水平表达的有效表达系统。此系统使用Autographa Californian核型多角体病毒(AcNPV)(Feighny R，Burrous J y Putnak R，用重组杆状病毒制备的2型登革热包膜蛋白保护小鼠免受病毒攻击，Am J Trop Med Hyg，1994，50(3〕：322-328〕。

除了用它们免疫的小鼠封闭了中和ACS，所得重组蛋白还表现与天然蛋白相似的大小、糖基化状态和抗原性(Matswra Y，Miyamoto M，soto T y col，重组杆状病毒表达的日本脑炎病毒包膜蛋白的特征鉴定，病毒学1989；173：674-682)。小鼠中的保护水平依赖于所用重组抗原的剂量，但是具有天然抗原性并含有保护性表位的重组蛋白用作免疫原时并不总是保护免受病毒感染(Shiu SYW，Reid HW y Gould EA，重组杆状病毒和痘苗病毒表达的羊跳跃病病毒包膜蛋白不能刺激保护性免疫，病毒研究1992；26：213)。用重组杆状病毒对D1(E)和日本脑炎病毒(VEJ-E)的研究表明存在抗病毒的中和Acs与保护作用之间的正相关(Zhao B，Prince G，Horswood R，Eckels K，Summer P，ChanockR，Lai C-J，由重组痘苗病毒表达登革病毒的结构蛋白和非结构蛋白，病毒学杂志1987；61：4019-4022)。因为使用不是人类病原体的昆虫病毒并具有进行真核动物蛋白正确加工的能力，此表达系统有望用于亚单位疫苗的生产。