[发明专利]从哺乳类细胞中获得脑型乙酰胆碱酯酶的方法

说明书

本发明涉及从生物细胞中分离纯化酶的方法，尤其是关于从非神经、非红细胞源的哺乳类细胞中分离纯化脑型乙酰胆碱酯酶的方法。

乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，AChE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut H，et al.J-Clin-Invest.1990，86(3)：900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches tocholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。乙酰胆碱酯酶以所在位置可分为神经肌肉型和红细胞型。按照分子结构可分为‘不同亚单位多聚体型’(heteromeric class)和‘相同亚单位多聚体型’(homomeric class)。不同亚单位多聚体型的催化亚单位与三螺旋胶原亚单位连接或与脂类连接。相同亚单位多聚体型又分为亲水性(hydrophilic)和亲脂性(glycophospholipid-linked)等亚型。红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶四聚体分子量约260KDa。乙酰胆碱酯酶的功能，在胆碱能神经系统是水解神经递质乙酰胆碱，使之生成胆碱和乙酸。也有报道认为乙酰胆碱酯酶具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性。近年来，由于体外培养的肿瘤细胞株也检测到AChE mRNA的转录和化疗后的卵巢癌患者的血清检测到乙酰胆碱酯酶活性，有作者认为乙酰胆碱酯酶与肿瘤发生有关(Lev-LehmanE，et al.Blood.1997，89(10)：3644-53)。

目前世界上商品化的乙酰胆碱酯酶，主要从人红细胞，牛红细胞，血清和电鳐等放电鱼类的电器官分离得到的，没有人脑的乙酰胆碱酯酶，究其原因，就是很难获得人脑用以分离纯化乙酰胆碱酯酶，因此，就人脑乙酰胆碱酯酶而言，市场供应是空白。

乙酰胆碱酯酶是哺乳动物体内重要的酶，除了作为神经递质乙酰胆碱的水解酶之外，其它细胞表达的乙酰胆碱酯酶的功能和意义仍然不清楚，研究人类乙酰胆碱酯酶，必需要以人类细胞产生的酶为对象，因此，对该酶的需要量很大。以人脑为来源分离得到乙酰胆碱酯酶的途径是有限的。如果有一个来源广泛易得，简单可靠的方法得到这种酶，就为研究开了方便之门。

另外，研究证明老年性痴呆患者病灶处有大量的乙酰胆碱酯酶存在，而且，与神经递质降解功能无关，那么它的出现意义是什么？如何研究它们？还有，已经证明老年性痴呆患者病灶处有凋亡细胞存在，那么二者有什么关系？这些都不清楚。要得到大量人脑来源的乙酰胆碱酯酶又很困难。本发明人多年来一直致力于在这领域中从事研究工作，从凋亡细胞中分离到脑型乙酰胆碱酯酶，用这种酶替代从人脑分离纯化的乙酰胆碱酯酶，其意义十分重大。

本发明目的是提供从哺乳动物包括人类的细胞株，除了已知的神经和红细胞外，正常状态下并不表达乙酰胆碱酯酶的细胞经过诱导凋亡后得到乙酰胆碱酯酶的方法。

本发明是一种从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，是从哺乳动物包括人类的一切细胞株(神经细胞和红细胞除外)经过诱导细胞凋亡，使之表达乙酰胆碱酯酶，再经过裂解细胞，tacrine亲和柱层析分离纯化，获得脑型乙酰胆碱酯酶的方法。

本发明从哺乳类细胞中获得乙酰胆碱酯酶的方法，在科学研究中是一个崭新创举。其原理是正常情况下不表达乙酰胆碱酯酶的细胞在细胞凋亡过程中表达脑型乙酰胆碱酯酶。因此，本方法首先是要获得凋亡细胞，然后收集经过诱导凋亡的细胞，分别抽提mRNA，DNA和蛋白质，可分别得到大量的乙酰胆碱酯酶AChE mRNA及其反转录RT-PCR产物、梯形DNA片断和有活性的乙酰胆碱酯酶。

本方法使用了非肿瘤细胞株和肿瘤细胞株。非肿瘤细胞株包括人肺成纤维细胞(HLF)、人脐静脉内皮细胞、小鼠内皮细胞(SIEC)、小鼠成纤维细胞株(NIH/3T3)、大鼠肝细胞株(BRL)、大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)。肿瘤细胞株包括HELA和PC-3、HL-60、M07e、HEL、DAMI等等。

诱导细胞凋亡可以采用多种方法，其中有物理(辐射)、化学(化疗药物)和生物(加或减细胞因子)方法和自然衰老法。自然衰老法最简单和廉价。