[发明专利]酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒

说明书

本发明涉及一种酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒，特别是一种酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒。

异常胎儿是胎儿、新生儿疾病与死亡的重要原因，是影响人口素质提高的重要因素，为最大限度地减少异常胎儿的出生，应尽早对胎儿进行产前诊断。目前，产前诊断方法较多，例如：母血AFP值测定，B超等，B超诊断虽然安全、无创伤，但诊断疾病的种类有限。近期发展了一种利用孕妇血中的妊娠蛋白产前筛查异常胎儿的诊断方法，这种方法的依据是：妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)含量随孕龄而稳定增加，PAPP-A是一种由胎盘合体滋养细胞分泌的大分子糖蛋白，该蛋白性质稳定，检测PAPP-A水平可直接了解胎盘情况，间接反映胎儿宫内发育。

本发明的目的是提供一种酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的试剂盒，该试剂盒中试剂性能稳定，组配合理，适用，检测准确，使用方便。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：这种酶联定量检测妊娠相关血浆蛋白A的试剂盒包括：试剂盒盒体，盒体内放置包被反应板以及分别包装好的试剂，试剂有：标准品、质控血清、酶标抗体，它们的组成分别是：

标准品：妊娠相关血浆蛋白A的冻干粉，其纯度为≥95％，

质控血清：妊娠相关血浆蛋白A的冻干粉，其纯度为≥95％，

酶标抗体：用辣根过氧化物酶交联的兔抗妊娠相关血浆蛋白A的抗体，其蛋白含量0.2-1.5mg/ml，

包被反应板：用于包被的抗体为兔抗妊娠相关血浆蛋白A的抗体，抗体浓度1mg/ml，双扩散效价＞1∶32。

试剂盒至少包括上述试剂和包被反应板外，为了方便，也可装入浓缩清洗剂、显色剂A、显色剂B、终止液、胶贴、半对数座标纸等。

所述的浓缩清洗剂为磷酸缓冲液，显色剂A为1％四甲基联苯胺(TMB)，显色剂B为过氧化氢，终止液为1M硫酸。

上述妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的纯度很高，可使用户作为数据参照基准的标准曲线更为可靠，本试剂盒中附加有质控血清冻干物，它可作每次检测是否成功的标志，以免作出错误的结论。

一、标准品的制备：

1、收集血清：收集孕周高于30周的孕妇静脉血，3000转/分离心20分钟，取血清于容器内，置-20℃冰箱内保存。

2、妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的纯化：

①饱和硫酸铵粗提：

由于PAPP-A可溶于饱和硫酸铵与血清组成的溶液中(即血清与饱和硫酸铵的体积比为2∶1)，因此，向血清中加入饱和硫酸铵至上述浓度时，PAPP-A溶解，其他蛋白以沉淀形式去除，分离沉淀后的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，当上清液：饱和硫酸铵=1∶1(体积比)时，PAPP-A沉淀分离。

②Sephadex G200层析：

层析，取5％床体积的血清样品，样品浓度6mg/ml，加样，收集，洗脱液为Tris-Hcl缓冲液。测定各收集管280nm、260nm波长下的OD值，计算蛋白浓度。经SDS-PACE垂直板电泳，检测其纯度，将具有高活性的PAPP-A合并，用中空纤维超滤膜浓缩。

③DEAE-Sephadex A-50离子交换层析

层析：样品量为床体积的10％，样品浓度为5mg/ml，

用0.03M PB为洗脱液，Nacl浓度从0-0.9M逐渐增加，连续梯度洗脱，收集第三峰，经浓缩。

④免疫亲合吸附：

吸附剂为CNBr-sepharose 4B，用稀酸浸泡并充分溶胀，使其与抗正常人全血清抗体蛋白偶联，上述免疫吸附剂抽干，加入样品，转载吸附，保留滤液用缓冲液将吸附剂洗至0D₂₈₀＜0.02。吸附剂再生，备用。

⑤将纯度达到95％以上的PAPP-A冻干，并取出一部分作为质控血清并冻干，每试剂盒中标准品的重量一般控制在0.5-2.5μg，质控血清冻干品的重量为0.3-1.0μg，上述重量可作二次PAPP-A含量测定。

二、酶标抗体的制备：

1、免疫动物：

选择2公斤左右的家兔作为免疫动物，先用5-10mg卡介苗注射刺激动物，7-10天后，将PAPP-A制成福氏完全佐剂抗原液，采用皮下多点第一次免疫，2周后，腹股沟皮下第二次免疫，2周后，试血和测效价。

2、抗血清分离，鉴定及保存：

待免疫血清效价上去后，抗血清的采集采用杀死动物一次性放血的办法，家兔可采70ml左右全血。无菌低温，5000g多次离心取血清。

免疫血清鉴定：

①抗体效价的测定-双向免疫扩散法；

②抗体含量测定-逆单相免疫扩散法；