[发明专利]分离突变体及克隆互补基因的新方法

权利要求书

1、一种核酸盒，包括编码一种双向标记的核酸序列，所述的核酸盒进一步包括与编码双向标记的核酸序列可操作地连接的一种基本转录单位，所述的核酸盒还包括以如此的方式与基本转录单位连接的一种可诱导增强序列或激活序列，所述的连接方式为在诱导增强序列或激活序列时能使编码双向标记的核酸序列表达，所述的可诱导增强序列或激活序列衍生自与一部分代谢的活性相关的基因，所述的可诱导增强序列或激活序列优选地衍生自与具有酶级联或反馈环或多重反馈环的代谢部分相关的基因。

2、权利要求1的核酸盒，其中双向标记选自由facB、NiaD、AmdS、Can1、Ura3、Ura4和PyrA基因及其同系物组成的一组。

3、权利要求2的核酸盒，其中双向标记选自由构巢曲霉的facB基因，黑曲霉的NiaD基因，米曲霉的NiaD基因，构巢曲霉的AmdS基因，粟酒裂殖糖酵母的Can1基因，啤酒糖酵母的Ura3基因，粟酒糖酵母的Ura4基因以及曲霉、木霉、青霉、镰孢、糖酵母和克鲁维氏酵母的PyrA基因组成的一组。

4、根据前述任一项权利要求所述的核酸盒，其中可诱导增强序列或激活序列正常参与调节酶级联。

5、根据前述任一项权利要求所述的核酸盒，其中可诱导增强序列或激活序列是包含在下述任一种核酸片段上的上游激活序列(UAS)，所述的核酸片段为：

-来源于分别编码阿拉伯呋喃糖苷酶A、阿拉伯呋喃糖苷酶B及内切阿糖胶酶的abfA、abfB和abnA基因的启动子的片段，

-来源于编码糖淀粉酶的glaA基因的片段，

-含有如在alcR和alcA启动子上的alcR结合位点的片段，

-来源于CUP1基因的片段，

-来源于PHO5基因的片段，

-来源于GAL1、GAL7或GAL10基因的片段，

-来源于xlnA基因的片段，

-来源于pgaII基因的片段。

6、根据前述任一项权利要求所述的核酸盒，其中可诱导增强序列或激活序列是包含在下述任一种核酸片段上的上游激活序列(UAS)，所述的核酸片段为：

-来源于分别编码黑曲霉的阿拉伯呋喃糖苷酶A、阿拉伯呋喃糖苷酶B及内切阿糖胶酶的abfA、abfB和abnA基因的启动子的片段，

-来源于编码黑曲霉的糖淀粉酶的glaA基因的片段，

-含有如在构巢曲霉的alcR启动子上的alcR结合位点的片段，

-来源于啤酒糖酵母的CUP1基因的片段，

-来源于啤酒糖酵母的PHO5基因的片段，

-来源于啤酒糖酵母的GAL1、GAL7或GAL10基因的片段，

-来源于构巢曲霉的xlnA、xlnB、xlnC或xlnD基因的片段，

-来源于黑曲霉的xlnB、xlnC或xlnD基因的片段，

-来源于塔宾曲霉的xlnA或xlnD基因的片段，

-来源于黑曲霉的pgaII基因的片段。

7、根据前述任一项权利要求所述的核酸盒，其中可诱导增强序列或激活序列正常参与碳代谢。

8、一种制备和筛选微生物突变株的方法，与未突变菌株相比所述突变能增强预定的代谢部分，所述方法包括：

-将前述任一项权利要求所述的核酸盒导入宿主，

所述的宿主在导入核酸盒之前不显示与双向标记的表达相关的表型，

-在使包含在核酸盒上的增强序列或激活序列正常活化并且双向标记能表达的条件下培养得到的微生物，

-在上述培养条件下筛选具有与双向标记基因的表达相对应的表型的转化子，

-将所选的转化子以已知方式诱变，

-在预定的代谢部分的可代谢底物的存在下，在如下条件下培养得到的菌株，所述的条件为具有与双向标记基因的表达相对应的表型的菌株可接受的条件，以及导致未突变的含核酸盒的亲本菌株中不表达双向标记的条件，

-在未突变的含核酸盒的亲本菌株中不表达双向标记的选择条件下筛选从诱变后的培养步骤得到的菌株，该菌株具有与双向标记基因的表达相对应的表型。