[发明专利]在种子中增加必需氨基酸积累的方法

说明书

                  本发明的领域

本发明涉及动物营养领域。尤其，本发明涉及在作为饲料的种子中增加营养含量的方法。

                     背景

饲料配方要为生长提供动物关键的必需营养物。然而，一般地农作物提供营养质量低的食物资源因为农作物含有低比例的一些单胃动物不能自我合成的必需氨基酸。

多年来研究人员试图通过育种方案来提高必需氨基酸在一些重要作物种子蛋白中的比例。随着对种子贮藏蛋白以及编码这些蛋白基因表达的更深了解，和更多种植物转化系统的建立，提高种子蛋白营养质量的分子手段能为较传统手段提供其它途径。因此，通过生物工程可增加某种作物特定的氨基酸水平。

其中一种方法是表达某种含有所需氨基酸成分的异源蛋白达到足以避免饲料的额外添加的水平。例如，一些富含硫氨基酸的种子蛋白已确定。这些蛋白正常表达的一个关键包括含有种子特异性启动子的有效表达盒。不但基因控制区域须指导合成高水平的mRNA，而且mRNA必须翻译成稳定的蛋白。

通常在这些动物营养需要的必需氨基酸中农作物缺乏的是甲硫氨酸，苏氨酸和赖氨酸。试图借助育种，突变选择和/或改变农作物积累贮藏蛋白组成来提高这些游离氨基酸水平只取得很小的成功。通常，表达转基因贮藏蛋白不会导致总的种子氨基酸足够的增加。由菜豆蛋白启动的巴西坚果2S表达盒是一种有效的嵌合种子特异基因的一个实例。然而，既使通过巴西坚果蛋白增加总甲硫氨酸和结合甲硫氨酸量，从而提高营养价值，但出现了一个在种子中积累甲硫氨酸总量的阈值限制。这些种子保留不足的甲硫氨酸作为甲硫氨酸源因此在用上述豆类作为食物时须有甲硫氨酸添加。

另一种通过改变目的氨基酸组成蛋白的水平来增加特定氨基酸水平的方法是氨基酸生物合成途径的修饰。重组DNA和基因转移技术已用于改变氨基酸生物合成途径中催化关键步骤酶的活性。Glassman，U.S.P.NO.5,258,300；Galili，et al.，European Pafent Application NO.485970；(1992)；在此全文引入。然而，修饰种子中氨基酸水平不总是联系着那些参入有这些氨基酸蛋白含量的变化。Burrow，et al.，Mol.Gen.Genet.；Vol.241；PP.431～439；(1993)；在此全文引入作为参考。在叶片和种子中增加游离赖氨酸水平已通过选择DHDPS突变体或在植物中表达大肠肝菌DHDPS而获得。然而，由于种子中游离氨基酸水平常常仅是总氨基酸含量的小部分，这些增加不足以有效提高种子的总氨基酸含量。

lysC基因是细菌天冬氨酸激酶的一个突变体，它对由赖氨酸和苏氨酸引起的反馈抑制不敏感。表达这一基因导致增加甲硫氨酸和苏氨酸生物合成的水平。然而，用种子特异的表达盒来表达这一基因导致在种子中仅有6～7％总苏氨酸或甲硫氨酸水平的增加。参阅Karchi，et al.，The Plant J.，Vol.3；PP.721～7；(1993)；在全文引入作为参考。因此，仅对种子营养价值有很小的影响，必需氨基酸的添加仍是需要的。

基于上述，仍存在对于一种增加植物种子必需氨基酸水平的方法的需求。从现有技术可知，前述方法不足以增加游离和结合氨基酸水平而有效地增加饲料营养含量。仍存在一种需求来100％，增加必需氨基酸水平，即双倍于现有水平。如果这个目标达到，添加将不再需求。

因此本发明的目标是提供方法从基因水平上修饰植物种子从而提高这种植物种子的必需氨基酸苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的水平。

本发明的进一步目标是作为食物和/或饲料提供比野生类型种同样种子含较高水平必需氨基酸，苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的种子。

本发明的进一步目标是作为食物和/或饲料提供加倍的必需氨基酸水平，从而能避免饲料添加需求的种子。

                      概述

本发明提供从基因水平上修饰植物种子从而提高必需氨基酸苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的水平的方法。这些方法包括一种把提供增加了的目标游离氨基酸类群之来源和某种伴随产生的，补充蛋白质沉积，结合起来的方法，其结果是一个超出预料提高了的蛋白质结合的目标氨基酸的积累。