[发明专利]α-hordothionin的高苏氨酸衍生物

说明书

技术领域

本发明涉及饲料制剂的改善，本发明尤其涉及能够在植物中提供较高百分含量的苏氨酸的α-HORDOTHIONIN衍生物。

发明背景

使用饲料制剂为动物提供对其生长起关键作用的必需营养物质是必要的。然而，农作物植物一般说来是低营养质量的食物来源，因为它们含有低比例的某些氨基酸，而这些氨基酸对动物来说是必不可少的，但又无法自身合成。

多年以来研究者们曾经试图通过杂交计划来改善重要的农作物蛋白质中必需氨基酸的平衡。随着更多地有关贮藏蛋白质和编码这些蛋白质的基因表达的知识得到了解，以及随着适用于更多种类植物的转化系统的发展，利用分子途径改善种子蛋白质营养质量为比较传统的途径提供了另外的选择。因此，在某一给定的农作物中的特殊氨基酸水平可以通过生物工程学方法得到增加。

一种可供选择的方法是在大量的足以免除食物或饲料添加剂的水平上来表达一种含有想要的氨基酸组合物的异源蛋白质。例如，许多富含含硫氨基酸的种子蛋白质已经得到鉴定。这些蛋白质很好地表达的关键涉及具有种子特异性启动子的有效的表达盒。不仅基因控制区域必须指导高水平的信使RNA的合成，而且信使RNA必须被翻译成稳定的蛋白质。

在动物营养必需的氨基酸中，农作物经常缺乏的是甲硫氨酸，苏氨酸和赖氨酸。通过育种，突变筛选和/或改变农作物中积累的贮藏蛋白质的组成来增加这些自由氨基酸的水平的努力很少曾取得成功。通常转基因贮藏蛋白质的表达水平太低。菜豆蛋白启动的巴西坚果2S表达盒是一个有效的嵌合种子特异性基因的例子，然而，虽然巴西坚果蛋白质中增加了总的甲硫氨酸和结合甲硫氨酸的数量，由此改善了营养价值，但是对于积累在种子中的甲硫氨酸总量似乎有一个阈值限制。其种子作为甲硫氨酸的来源仍然是不充足的。

另一种通过改变含有希望得到的氨基酸的蛋白质水平来增加特殊氨基酸水平的可供选择的方法是对氨基酸的生物合成进行修饰。重组DNA和基因转移技术已被用于改变氨基酸生物合成途径中催化关键步骤的酶的活性。Glassman，美国专利申请号NO.5,258,300；Galili等，欧洲专利申请号NO.485970；(1992)；在此全文引入作为参考。然而，种子中氨基酸水平的修饰并不总是与结合这些氨基酸的蛋白质水平的变化有关。Burrow等，Mol.Gen.Genet.Vol.241；pp.431-439；(1993)；在此全文引入作为参考。虽然通过选择DHDPS突变体或者将大肠杆菌(E.Coli)DHDPS在植物中进行表达能够使叶子中游离氨基酸的水平得到显著增加，但仍显示出这些改变只能增加代表着占氨基酸总量大约90％左右的靶结合氨基酸，对种子的营养价值只有极小的影响。

基于前述的原因，有必要寻找方法增加植物种子中苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸等必需氨基酸的水平。

因此，本发明的目的之一正是为通过植物遗传修饰来增加植物中必需氨基酸苏氨酸的水平提供方法。

本发明更深入的目的是提供与同类种子的野生型相比，具有更高水平必需氨基酸苏氨酸的种子作为食物和/或饲料。

发明内容

已经发现一类化合物，α-hordothionins，可被修饰以增加它们的苏氨酸含量。α-hordothionin是一种已经得到充分认识的45个氨基酸的蛋白质，它可以从大麦(Hordeum vulgare)种子中分离得到。其分子由于8个半胱氨酸残基形成的4个二硫键而保持稳定，序列I.D.NO.1提供了其氨基酸序列。在天然形式下，它尤其富含精氨酸和赖氨酸残基，分别含有5个残基(10％)，但只含有3个残基(7％)的必需氨基酸苏氨酸。

此蛋白质已被人工合成，并且其三维结构已通过计算机模型得到确定。蛋白质模型表明10个带电荷的残基(位置5，10，17，19和30上的精氨酸及位置1，23，32，38和45上的赖氨酸)都出现在分子的表面。极性氨基酸(位置11上的天冬酰胺，位置22上的谷氨酰胺和位置41上的苏氨酸)的侧链也出现在分子的表面上，再者，疏水氨基酸(例如位置8，15，24和33上的亮氨酸及位置18上的缬氨酸的侧链)也是靠近溶剂的。

蛋白质的三维模型显示出位置10上的精氨酸残基对于保持合适的三维结构和通过其与蛋白质C-末端残基的氢键作用进行合理的折叠是非常关键的。在这一位点上替换成苏氨酸会打破涉及位置10上的精氨酸，位置2上的丝氨酸和位置45上的赖氨酸的氢键，导致结构稳定性的破坏。具有这种替换的合成多肽无法正确折叠，更加支持了这一分析。位置10上的精氨酸残基的保留提供了正确折叠的蛋白质。