[发明专利]新型蛋白质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质，它来源于MP52，具有序列表中序列号1的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白质的二聚体以及由这种二聚体蛋白质作活性成分形成的用于治疗软骨和骨疾病的药剂。本发明还涉及一种方法，就是用含有能表达上述蛋白质DNA序列的质粒转化大肠杆菌，然后用大肠杆菌制备大量、高纯度的上述蛋白质。另外，本发明涉及一种治疗方法，即施用二聚体蛋白质来治疗软骨、骨疾病。技术背景

现在已知用于预防和治疗骨疾病的药剂有雌激素、降钙素、维他命D3及其衍生物，以及二磷酸盐的衍生物等。最近报道TGF-β基因超家族的骨形成因子(骨形态发生蛋白：以后称作BMP)，包括BMP-2到BMP-9等一系列蛋白质有骨形成作用。

另外也有报道一种叫做MP52的蛋白质(WO93/16099及WO95/04819)具有骨形成作用。人们认为成熟型MP52是N端有丙氨酸的120个残基形成的蛋白质，其氨基酸序列在这些申请中有所描述。

自然，Vol.368、p.639-643(1994年)及WO94/15949中也记载了一种叫做GDF-5的蛋白质，它来源于小鼠，氨基酸序列与MP52很相似。

但是，以工业规模制备这些蛋白质的纯品很还容易。

曾尝试应用哺乳动物细胞如L-细胞通过遗传工程技术来制备MP52，但是不容易制备大量的纯品MP52。

发明的公开

本发明者们尝试用大肠杆菌，通过遗传工程技术来大量制备MP52。也就是把编码甲硫氨酸的密码子加到从丙氨酸开始编码MP52的DNA5′末端，用这样的大肠杆菌来制备MP52。产物不仅是MP52，而是MP52的混合物，还包括N端为甲硫氨酸的121个残基形成的蛋白质，以及N端脱落丙氨酸而从脯氨酸开始的119个残基形成的蛋白质，这很难从中分离出纯化MP52。

本发明者发现把编码甲硫氨酸的密码子与编码序列表中序列号1中氨基酸序列的DNA 5′末端结合，序号1的序列由MP52 N末端删除丙氨酸后119个残基形成，这样来构建质粒，然后用导入了质粒的大肠杆菌来表达，这样可选择性地大量生产N末端从脯氨酸开始的序列表中序列号1的蛋白质。

而且本发明证实序列表序列号1中所述蛋白质的二聚体有软骨和骨形成作用，由此完成了本发明。

本发明涉及一种蛋白质，它具有序列表序列号1所示的氨基酸序列。该蛋白质由119个残基组成，119个残基是从人MP52 120个残基形成的成熟区的N末端去除丙氨酸后形成的。本发明的蛋白质溶于水，而且因为它来源于人类，所以自身的毒性很小。

另外，本发明涉及一种用于软骨和(或)骨疾病治疗的药剂，它包括蛋白质的二聚体，而该蛋白质具有序列表中序列号1的氨基酸序列。更具体而言，由于本发明的蛋白质二聚体具有形成软骨、骨的活性，所以本发明涉及用于预防及治疗下列疾病的药剂：骨质疏松症，先天性软骨、骨疾病，变形性膝关节炎、变形性股关节症等变形性关节炎，骨关节炎，半月板损伤等软骨损伤，外伤、肿瘤切除等造成的骨、软骨缺损部分的再生，骨和软骨的缺损，骨折，软骨发育不良、软骨发育不全，无软骨形成、腭裂、骨形成不良等先天性软骨和骨疾病，另外还有牙根、牙槽的缺损等。因为本发明的蛋白质具有形成软骨、骨的活性，所以它可用于治疗整容外科的骨移植。这些治疗也包括兽医外科领域的治疗。

本发明涉及一种方法，它是用大肠杆菌来制备一种蛋白质，该蛋白质由序列表中序列号1所示，来源于人MP52的119个氨基酸残基组成。

另外，本发明涉及质粒的构建，该质粒含有编码序列表中序列号1所示来源于人MP52的119个氨基酸残基序列的DNA，其5′末端的编码甲硫氨酸。用聚合酶链式反应(PCR法)仅对人MP52 cDNA的成熟区域进行扩增，其中用含有WO93/16099中cDNA的质粒载体作模板DNA。这里所用的PCR法通常指用美国专利4,683,195中描述的方法来扩增DNA或RNA的微量片段。