[发明专利]有机酸的产生被阻抑了的新的大肠杆菌突变株

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及在有氧条件下生长在补加有葡萄糖的培养基中其发酵有机酸(特别是乙酸)的产生被阻抑了的新的大肠杆菌突变株。该菌株产生的有机酸的减少使它成为使用高密度有氧发酵方法生产重组蛋白质的优秀的宿主菌株。

2.现有技术的描述

为了产生有用的重组蛋白质，大肠杆菌被广泛用作高细胞密度有氧发酵的宿主菌株。因为葡萄糖既廉价又易于做为可利用的碳源和能源，为获得宿主细胞的高密度生长以及重组基因的很好表达，大量的葡萄糖被加入到培养基中。高细胞密度有氧发酵过程中存在的主要问题是有发酵酸性副产物产生，其中乙酸是最主要的副产物。酸性副产物、尤其是乙酸的产生是限制高细胞密度生长的主要因素，因此亦是限制重组蛋白质生产的主要因素(Han et al.，Biotechol.Bioeng.(生物技术生物工程)，39，663(1992)；Luli et al.，Appl.Erviron.Microbiol.(外界应用微生物学)，56，1004(1990)。

为了解决这些问题，已经使用了下列技术或方法：养料分批供应培养技术(Fieschko等，Chem.Eng.Commun.(化学工程通讯)，45，2875(1986)；Ohta等，J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工程杂志)，75，155(1993)；Yang，J.Biotechrol.(生物技术杂志)，23，271(1992))、从培养物中将产生的有机酸除去的方法(Landwall等，J.Gen.Microbiol.(微生物遗传学杂志)，103，345(1977)；Meyer等，Proceedings of the 3rd European Congress on Biotechnology(第三届欧洲生物技术大会记录汇编)，(1984)；MacDonald，Appl.Environ.Microbiol.(外界应用微生物学)，56，640(1990))或者更换培养基组合物(Holmes，Curr.Topics Cell.Regul.(细胞调控的当前课题)，28，69(1986)；Han等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术生物工程)，41，316(1993)；Reiling，J.Biotechnol.(生物技术杂志)，2，191(1985)；Mori等，J.Ferment.Technol.(发酵技术杂志)，50，519(1972)。然而，这些方法仍有局限性：以致于生长速率缓慢和这些培养条件导致的培养物的代谢活性较低常常使重组蛋白质的产量较低；控制错综复杂的营养供应非常麻烦而且容易出错(Chou等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术生物工程)，44，952(1994)；为控制pH而加入到培养基中的盐经常引起宿主生长的抑制和/或抑制产物产生(Jensen等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术生物工程)，36，1(1990))。

对于大肠杆菌在有氧条件下的葡萄糖代谢，超过其TCA循环能力的碳流被转化成乙酸，所述的乙酸被分泌到细胞外(Majewski&Domach，Biotechmol.Bioeng.(生物技术生物工程)，35，732(1990))。分泌出的乙酸抑制宿主菌株的生长及所需重组蛋白质的产生。乙酸是在磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ack)的连续作用下从乙酰辅酶A产生的。发现乙酸形成酶的突变性失活(通过使pts和ack基因缺失)可使乙酸的产量减少，但仍有相当大量的乙酸产生。该突变还引起乳酸和丙酮酸的积累(Diaz-Ricci等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术生物工程)，38，1318(1991))，至使乳酸和丙酮酸的累积量比其亲代菌株的还高。这些结果提示乙酸的产生还有另外的途径，而且已知的乙酸生物合成途经的失活使碳流流向其它的有机酸。

因此，一直需要努力不懈的研究，以开发出使有机酸的总产量减少并因此使所需的重组蛋白质的产量增加的新菌株。

发明概述

因此，本发明的一个目的在于提供新的大肠杆菌菌株，该菌株的有机酸产生被阻抑了，而其生长或重组蛋白质的产生却不受抑制。

该目的可用大肠杆菌新菌株JL1506(E.coliJL1506)来实现；E.coliJL1506在有氧条件下在葡萄糖培养基中生长的期间，其有机酸的产生被阻抑了。

本发明的另一个目的在于提供产生重组蛋白质的方法，所述方法将所述菌株E.coli JL1506用作表达宿主系统。