[发明专利]重组核酸序列和检测样品的基因毒性与诱变性以及基因毒性的动力学的方法

说明书

目前有多种不同的使用微生物筛选基因毒性和/或毒性化合物的方法。Ames测试(Maron and Ames,1983)似乎是一种最广泛使用的测定毒性化合物的方法并因而在世界范围内被推荐使用。但完成该测试要花费大约三天的时间，同时该方法还伴有一些明显的缺点。

已引入了某些可短时间内完成的方法，这些方法包括，根据lacZ基因表达的β半乳糖苷酶的量来检测因DNA损伤引起的SOS反应，其中所说的lacZ基因位于SOS调节的umuD、C或sfiA应激诱导型启动子的下游。这些测试分别称为使用鼠伤寒沙门氏菌作为宿主微生物的umu测试(Oda等，1985)和使用大肠杆菌作为宿主微生物的SOS显色测试(Quillardat等，1982)。在umu测试和SOS显色测试中，在待检样品存在下培养宿主微生物，继之破坏该宿主微生物。然后加入β半乳糖苷酶的底物，约10分钟后加入抑制剂终止随后的反应，然后在两个波长处进行OD测量并计算β半乳糖苷酶活性。这些测试克服了Ames测试耗时长的问题，但它们也有自身的缺点，即灵敏度低而且检测时间仍需7-8小时，特别是硝基芳烃和多环芳烃的检测灵敏度低。另外，该检测方法还需要大量的操作和加入各种不同的试剂，从而使该方法很复杂并且花费高。由于为了检测任何诱导作用而必须破碎细胞，所以只可能对细胞进行一种检测。

EP-A-0649905述及，将SOS基因放在表达荧光素酶活性的基因上游，以使荧光素酶的表达与SOS基因的表达同时发生，从而可以克服上述测试的缺点。然后通过检测发光可在短时间里检测或测定诱变物质。据称任何SOS基因都是有用的，并且在实施例中以umuD、C基因(当用于umu测试中时)为例作了说明。另外，与SOS显色测试和umu测试等常规测试相比，由于该测试中检测所需的样品体积较小，所以认为其提高了检测的灵敏度。除了其必须是SOS可诱导型外，再没有与待用启动子相连的序列。又因为发光是即刻的，所以可以比使用Lac系统更早地进行检测，从而缩短了检测时间。

WO94/13831(DuPont)中还公开了与发光基因复合物结合使用应激诱导型启动子，以提供基因工程微生物。他们指出，“虽然已证明应激反应在检测各种环境危害中是有用的，但它须与易于检测的灵敏报道基因相连接”。DuPont公司提供了一个广泛的现有技术中已知的应激诱导型启动子清单，这些启动子可能是有用的，但本发明不只限于这些。所列清单包括下列调节系统的启动子：热休克、SOS、过氧化氢、超氧化物、脂肪酸饥饿、通用应激、静止状态、应急、分解代谢产物活化、P利用和N利用。在实施例中，他们使用了热休克调节的蛋白质启动子dnaK和grpE、SOS调节的启动子recA和uvrA、氧化损伤调节的启动子katG和micF、通用应激启动子uspA、静止期启动子xthA、来自氨基酸饥饿系统的his启动子、涉及碳饥饿系统的lac启动子、来自磷酸盐限制系统的phoA启动子和来自氮限制系统的glnA启动子。估计他们从很宽范围的不同调节方式的启动子中举出如此多的例子，是要说明他们的系统具有宽范围的适用性。其中未指出或可推断中优选使用某个特定组的启动子或任何个别启动子。只在其中的一个实施例(专利申请的实施例12)中明显地列举了一个特定的SOS调节的启动子，其中给出了SOS调节的启动子recA得到的结果。使微生物与加有诱变剂溴乙锭(浓度为0.25mg/ml)的样品接触，于加入诱变剂后180分钟测得诱导率为1.9。加入0.5μg/ml丝裂霉素C,100分钟后测定诱导率。依据所用测试菌株的不同，诱导率在4.7至20之间变动。根据DuPont的专利申请的实施例12可明显看到上述结果。

我们已不可预见地发现了一个应激诱导型启动子的亚组，即一个SOS调节的启动子的亚组，其与发光报道基因结合用于微生物系统估测致突变性得到了改善的结果。该亚组并不包括SOS调节的RecA启动子。该亚组具有许多优于DuPont RecA-荧光素酶系统及本领域已知的其它微生物毒性测试系统的特点。在以特定方式使启动子突变而进一步测试和开发这些新的系统中，我们能够更大程度地改善其性能。此外还完成了新的测试方法。这些新测试方法使我们能够获得迄今任何已有的微生物毒性测试中未曾述及的、更多更好的数据。