[发明专利]抗Ⅳ型胶原酶单链抗体

说明书

本发明属于基因工程产品领域，是一种用于抑制肿瘤细胞转移的基因工程单链抗体。

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤病人死亡的主要原因(Liotta，L.A.，Steeg，P.S.，Stetler-Stevenson，W.G.1991)。阻止肿瘤转移是治疗肿瘤的关键。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞首先穿过基底膜进入毛细血管，随血流到达远隔部位形成继发瘤。正常的基底膜主要是由连续致密的胶原蛋白和糖蛋白等成分组成，其中Ⅳ型胶原在基底膜中起支架作用，是保持基底膜结构完整的关键成分。当肿瘤发生时，肿瘤组织内Ⅳ型胶原酶的表达及其活性明显增高，继而降解基底膜中的Ⅳ型胶原蛋白，破坏基底膜，造成肿瘤细胞的侵袭和转移。因此寻找一种能抑制Ⅳ型胶原酶的物质，通过封闭Ⅳ型胶原酶的活性，而阻止肿瘤细胞的侵袭和转移已成为控制癌转移的重要策略(Stetler-Stevenson，W，G.1992；Liotta，L，A.，et al.1991)。

目前国内外已发现一些具有抑制Ⅳ型胶原酶活性的物质，如金属蛋白酶抑制，能够与Ⅳ型胶原酶结合并抑制Ⅳ型胶原酶的活性。有实验证明金属蛋白酶抑制剂能够降低肿瘤细胞的侵袭性。另外还有实验证明，用维甲酸处理人黑色瘤细胞，可降低细胞内Ⅳ型胶原酶的mRNA水平，使黑色素瘤的侵袭能力减弱(Sceenath.T.，et al.1992)。然而，上述的抑制作用都是非特异性的，在应用上会带来副作用。至今还未见到能够与Ⅳ型胶原酶特异性结合的抑制剂。

本发明的特点是利用抗体高度特异性的特点，研制抗Ⅳ型胶原酶抗体。通过抗体与Ⅳ型胶原酶的特异性结合，封闭肿瘤组织中Ⅳ型胶原酶的活性，从而达到抑制肿瘤细胞转移的目的。

本发明是利用生物工程技术，研制抗Ⅳ型胶原酶基因工程抗体。所采用的技术方案如下：从分泌Ⅳ型胶原酶单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、纯化mRNA。体外反转录cDNA。用PCR技术，在反应体系中加入cDNA和一套抗体轻链或重链可变区引物(Pharmacia)，10×PCR缓冲液，dNTP终浓度为2.5mM，2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环的条件是：94℃变性30秒，55℃退火90秒，72℃延伸90秒，反应进行到最后一个循环后在72℃中保温10分钟。用Sephagels^TM Bandprep Kit(Pharmacia)回收轻链和重链可变区基因扩增产物。然后用一段编码(Gly₄Ser)₃的连接DNA把回收的轻链和重链可变区基因在等摩尔浓度的条件下，通过7次退火循环连接而成单链抗体基因。每个循环的反应条件为94℃变性30秒，64℃退火4分钟。以单链抗体基因为模板，在上述反应体系中，加入一对5’端含Sfi 1和3’端含Not 1酶切位点的引物，进行30次PCR循环，每次循环条件为94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟。最后一次循环后在72℃中保温10分钟。用Sepheglos^TMBandPrep Kit回收PCR产物。回收的单链抗体基因分别经过限制性内切酶Sfi 1和Not 1消化。在T4连接酶的作用下，与经过Sfi1和Not1双酶切的pCANTAB5E载体连接。连接反应条件为16℃过夜。将含单链抗体基因的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞。在辅助噬菌体K07辅助下，产生重组噬菌体抗体。采用免疫亲和筛选方法，把含有重组噬菌体抗体的上清与包被于聚乙烯平皿中的Ⅳ型胶酶共温育2小时。用含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗平皿20次，每次20ml。弃去PBS，在平皿内加入10ml处于对数生长期的TG1细胞，于37℃温育1小时。然后培养过夜。离心，取上清。进行下一轮筛选。重复“感染-扩增-筛选”过程3-4后，再感染TG1细胞，铺板过夜培养。从平板上随意挑选单菌落于30℃培养过夜。用M13 K07辅助噬菌体感染细胞，于37℃过夜培养。离心后取上清。用ELISA筛选Ⅳ型胶原酶噬菌体抗体。把那些与抗原结合活性最高的阳性克隆挑选出来，转入大肠杆菌HB2151。在IPTG的诱导下，表达可溶性Ⅳ型胶原酶单链抗体。收集含单链抗体的培养上清，并用50％硫酸铵沉淀，进一步用Sephadex G-75层析柱纯化单链抗体。

免疫活性鉴定证明该单链抗体能够与Ⅳ型胶原酶特异性结合。抗体COIV-19是目前已知的唯一能够与Ⅳ型胶原酶特异结合的小分子基因工程抗体。它将应用于恶性肿瘤的治疗。

实施例