[发明专利]一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法

说明书

农业生产中的真菌病害危害严重，发病面积广泛，是一种十分难以防治的植物病害。一些真菌病害如水稻稻瘟病、油菜菌核病、马铃薯晚疫病和黄瓜灰霉病等对农作物生产危害极大。在过去的研究中，人们在防治真菌病害方面主要采取了以下几种方法：使用化学农药；利用常规育种技术培育抗病品种；通过遗传工程手段将外源抗病基因导入作物使其具有抗病性状；利用微生物来源的产物防治病害。其中由于微生物制剂对环境和人类安全无毒而受到人们的重视。例如，木霉(Trichoderma sp.)和粘帚霉(Gliocladium sp.)产生的胞外壳多糖水解酶和葡聚糖水解酶可用于防治植物病害。其中有些酶已提纯。从T.harzianum P1菌株培养液中提纯的内-壳多糖酶、壳二糖酶、N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶和一种葡糖苷酶，以及从绿粘帚霉(G.virens)41菌株培养液中提纯的内壳多糖酶等，都对真菌孢子萌发、细胞复制和菌丝生长有抑制作用。它们对各种真菌的抑制ED₅₀值在32-200μg/ml之间(Lorito，M.et al.，Molecualr Biotechnology，2：209，1994)。又如，处理水果和蔬菜的新杀真菌剂包括由季也蒙毕赤酵母、汉森德巴利酵母、酿酒酵母、噬油假丝酵母(Candida oleophila)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、胶红酵母(Rhodotorulla mucilaginosa)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosprioides)、灰葡萄孢和指状青霉提取的胞外多糖。这种杀真菌剂对植物病原真菌如指状青霉、扩展青霉、意大利青霉、灰葡萄孢、仁果链核盘菌(Monilinia fructicala)和葡枝霉根(Rhizopus stolonifer)有效。此杀真菌剂是天然的，对人或环境无害。这种杀真菌剂含0.01-1.0％多糖、全酵母细胞、稀释辅料及其它杀真菌剂等(Droby S et al.，1995，Derwent BiotAbstr 14：95-07174)。还如，日本专利(平6-133763)报道用枯草芽孢杆菌SD142的培养液或菌体作为杀菌剂。美国EcoScience公司的Stack.J等发现丁香假单孢杆菌的新菌株ATCC55389可用作抑制水果微生物腐败的生物防治剂(WO9515085)。例如用于苹果、柑桔、柠檬、葡萄柚(Derwent BiotechnologyAbstracts，14：71，1995)。美国环保局已经批准马里兰州EcoScience Corp的杀真菌剂Bio-Save 10和11在美国上市，Bio-Save用的是从水果表面分离到的微生物，用于防治收获后的水果病害(Biotechnology News vol15.No9.p10.19954.17)。

在防治作物的真菌病害方面人们常常使用化学农药，但化学农药的使用已经造成了许多问题：(1)生产成本增加生产化学农药需要大量的资金投入，要求的设备复杂、工艺水平先进；(2)加速病菌产生抗药性经多次反复使用化学农药后，自然界中的病菌容易突变产生抗药性，这样人为地给病菌防治造成困难；(3)化学农药施用后在自然界中不易分解，残留的农药造成环境污染的同时还会极大地损害人类的健康；(4)滥用化学农药还会使生态环境遭到破坏、影响生态平衡。同时由于真菌是低等真核生物，其生活史要经历有性世代和无性世代，种类极其复杂而且容易发生变异，因而开发安全有效的新型广谱抗真菌生物制剂显得尤为重要。为此我们在具有高表达能力的生物反应器-酵母中生产这种抗真菌生物制剂，经发酵后上清液可用来制备产品，而酵母经过简单处理可作它用。因此本发明的一个目的是在真核生物中生产新型广谱无公害抗真菌生物制剂。