[发明专利]杆菌衍生的转谷氨酰胺酶

说明书

本发明涉及(1)由象枯草芽孢杆菌等这样的杆菌生产的转谷氨酰胺酶(下文称为TG)，(2)具有转谷氨酰胺酶活性的组分，和(3)生产具有交联结构的蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合体，肽或其衍生物的方法，其特征在于通过TG或有TG活性之组分的作用交联蛋白质，非蛋白质氨基酸聚合物、肽或衍生物中的Gln和Lys残基，由此在蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物，肽或其衍生物形成分子间或分子内交联的ε-(γ-Glu)-Lys键。

本发明还涉及(4)编码得自象枯草芽孢杆菌等这类杆菌之转谷氨酰胺酶的DNA，涉及(5)通过将载体DNA与所述DNA相连而得到的重组DNA，涉及(6)用所述重组DNA转化的细胞，和(7)通过培养所述转化体而生产杆菌衍生的转谷氨酰胺的方法。

通过TG或有TG活性之组分的作用而形成的具有交联结构的蛋白质、非蛋白质氨基酸聚合物、肽和其衍生物在本文中称为交联的聚合物。

TG是一种催化肽链中存在的Gln残基中γ-羧基酰胺底物的转酰基作用的酶。在肽链Lys残基中的ε-氨基是酰基受体的转酰基作用中，在肽分子间或内形成分子内或分子间交联的ε-(γ-Glu)-Lys键(下文称为“GL键”)。在水是酰基受体的转酰基作用中，通过Gln残基变成Glu残基。而使肽链中的Gln残基去酰胺化。

利用本发明杆菌衍生的TG可以生产交联的聚合物。将由此生产的交联聚合物用于食品，例如豆腐(Soybean curd)，布丁、酸奶、奶酪、底栖鱼肉、煮沸的鱼糊，香肠和其他鱼和内产品中以及化妆品等中。

迄今为止，已知TG存在于许多动物组织中。例如，已研究了存在于豚鼠肝中的TG(见Connelllan etal.，Journal of Biological Chemistry，Vol 246，pp1093-1098，1971)。有关微生物衍生的TG，迄今只报道了得自放线菌(放射状真菌)或枯草芽孢杆菌的TG(见M.V Ramanujam et al，FASEB J.Vol4，A2321)和得自粘菌(有粘液的霉菌)的TG(见J.D.Klein et al，J.Bacterial，Vol 174，2599-2605)。到目前为止由放线菌生产的TG已投入实践和工业应用(见日本专利公开No.6-65280，日本特许公开No.1-27471)。

由于下列原因，特别是在生产交联聚合物时，工业化利用得自动物，如豚鼠的TG有明显的缺陷。

很难以低成本得到大量的所述动物衍生的TG。另外，由于TG有需求钙离子的特性，所以它的使用受到限制。

放线菌衍生的TG也有一些不利因素。由于放线比普通细菌生长得慢，因此它们需要一个长培养期，从而增加了生产TG的成本。

新墨西哥州立大学的Ramanujam等人已报道了存在枯草芽孢杆菌衍生的TG。然而由其报道的TG有下列特性。

1)其适宜的pH在9.5或更高。2)由于其活性很大程度上受螯合剂(EDTA)的抑制，因此认为TG有需要金属离子的特性(3)为5mM或更高浓度的Ca²⁺抑制。4)被DTT抑制。5)由营养细胞和产生孢子细胞均可生产。

由于上述特性，特别是其适宜的pH高而且又受金属离子的影响，因此，TG的实际应用受到限制。

正如上文提到的，问题存在于1)当动物衍生的TG用于工业应用时，由于其本身需钙离子的特性，而且生产成本高而使其受到限制，2)当将放线菌衍生的TG用于工业应用时，放线菌的生长的比细菌的慢，因此提高了生产成本，和3)若将由新墨西哥州立大学的研究者报告的枯草芽孢杆菌用于工业应用，则由于其为5mMCa²⁺抑制，所以不能用于食品中。

因此，本发明的目的是从迄今已用于生产食品的杆菌，例如枯草芽孢杆菌等中分离新的TG，并提供由使用TG而生产交联聚合物的方法。

我们本发明人进行了艰苦的研究以致从已用于食品生产的微生物，例如枯草芽孢杆菌等中，得到一种新的TG，结果发现杆菌，如枯草芽孢杆菌等有一种新TG。以此发现为基础，我们完成了本发明。