[发明专利]参与酯酶分泌机制的基因

说明书

本发明涉及一编码一参与沙雷氏菌属的微生物的酯酶分泌机制的多肽的基因DNA，一包含该基因的重组质粒，一用此重组质粒转化的新型微生物，一同时含有上述重组质粒和带有编码一酯酶的基因的重组质粒的新型微生物，以及一通过培养这些新型微生物进行酯酶生产的过程。

近来，人们经常尝试将一些酶如酯酶用于水解反应。为此目的人们发现了各种各样的酯酶，如：来源于动物(如猪的肝脏、猪的胰脏等)的酯酶以及由微生物如球形节细菌(Arthrobacterglobiformis)、白地霉(Geotrichum candidum)、CandidaCylindracea、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等所产生的酯酶。另外，众所周知由灵杆菌产生的酯酶是经重组DNA技术制备的。

然而，已知的酯酶和已知的生产酯酶的方法都有各种各样的问题。例如来源于动物的酯酶都很贵，来源于微生物的酯酶则在酶的活性、稳定性或特异性等方面有缺点或者是生产酯酶的微生物没有高的生产率。另外，即使利用基因重组的微生物，仅仅通过扩增酯酶基因将酯酶产率提高到适用于工业生产的水平也不一定容易。此外，即使提高了酯酶的产率，酯酶的胞外分泌有时也会不足，因此就要求复杂的程序回收此酶。

各种考察的结果表明本发明者已成功地获得了编码一参与沙雷氏菌属的微生物的酯酶分泌机制的多肽的基因(DNA)，并已进一步发现经用含该DNA的重组质粒转化该微生物可显著提高此酯酶产生微生物分泌酯酶的能力，基于这些新的发现本发明已经成功地完成了。

本发明的目的之一是提供编码一参与沙雷氏菌属的微生物的酯酶分泌机制的多肽的基因。本发明的另一目的是提供一通过将该基因插入一载体质粒而形成的重组质粒并进一步提供一含该重组质粒的转化子。本发明的又一目的是提供一通过培养该转化子并收集转化子细胞内外积累的酯酶以生产酯酶的方法

附图简要说明

图1列示了从实施例2的重组细胞中分离出的质粒pPKHE200，pPKHE75，pPKHE35，pPKHE90和pPKHE65的限制性内切酶图谱。

此编码一参与酯酶分泌机制的多肽的基因(此后称为“酯酶分泌基因”)为一长4,466个碱基对的双链DNA，序列中有三个开放的阅读框架(ORF)，尤其含有示于后面的序列身份号1中的核苷酸序列。

此酯酶分泌基因的供体微生物包括属于有酯酶生产能力的沙雷氏菌属的任何微生物如：灵杆菌Sr41(FERM BP-487)，液化沙雷氏菌ATCC 27592，灵杆菌ATCC 13880，灵杆菌ATCC 14764，灵杆菌ATCC 19180，灵杆菌ATCC 21074，灵杆菌ATCC 27117，灵杆菌ATCC 21212等。

插入酯酶分泌基因的载体质粒包括在被转化的细胞中可复制的任何质粒。其中，该质粒最好是那些拷贝数在1至几千、带有一对抗生素如氨卡青霉素、卡那霉素、氯霉素的抗性标记并带有适当的启动子如lac，tac或trp的质粒。此外，载体质粒可进一步携带一质粒稳定基因如par和parB。

这些载体质粒包括如pLG339[Gene，Vol.18，332(1982)]，pBR322[Gene，Vol.2，95(1977)]，pUC18[Gene，Vol.33，103(1985)]，pUC19[Gene，Vol.33，103(1985)]，pHSG298[Gene，Vol.61，63(1987)]，pHSG299[Gene，Vol.61，63(1987)]及类似的其他质粒。

上述这些质粒可购得，也可通过一常规方法如“廓清裂解物片”(参见Yasuyuki Takagi，“Procedure for Experimentin Genetic Engineering”，125页，Kodansha出版，1980)或“碱裂解片”(参见Maniatis等，Molecular Cloning″，368页，美国科尔德斯普林港实验室(1982)]从含这些质粒的微生物中获得。