[发明专利]用于乳头状瘤病毒的多核苷酸疫苗

说明书

相关的其它申请

这是1994年6月30日提交的，现正在决定中的U.S.S.N.08/268.424的部分继续。发明领域

本发明涉及新的药物产品的生产和使用：一种核酸，当它被直接导入活的脊椎动物组织中时，可诱导一种特异性识别乳头状瘤病毒的免疫反应。发明背景

乳头状瘤病毒(PV)感染可在包括人，绵羊，狗，猫，兔，猴，蛇和牛的各种动物中发生。乳头状瘤病毒感染上皮细胞，一般地在感染部位诱发良性的上皮或纤维上皮瘤。乳头状瘤病毒是种属特异性的感染原，例如，人乳头状瘤病毒一般不感染人以外的动物。

依据它们感染的宿主，可将乳头状瘤病毒划分为不同的组。根据DNA序列的同种性可进一步将人乳头状瘤病毒(HPV)划分为超过60种类型(综述，参见乳头状瘤病毒和人类癌症，H.Pfister(ed.)，CRC Press，Inc.，1990)。乳头状瘤病毒感染可诱导类型特异性的免疫原性反应，其中针对一种类型的乳头状瘤病毒的感染的中和免疫不会赋于对另一种类型的乳头状瘤病毒的免疫。

人不同类型的HPV引起不同的疾病。HPV类型1，2，3，4，7，10和26-29在正常和免疫损伤个体中都引起良性疣。HPV类型5，8，9，12，14，15，17，19-25，36和46-50在免疫损伤个体中引起扁平(flat)疣损害。HPV类型6，11，34，39，41-44和51-55引起非恶性的生殖道湿疣。HPV类型16和18引起生殖道上皮发育不良并且与大多数的原位和侵袭性的子宫颈癌，阴道癌，外阴和肛管癌相关。

动物系统中的免疫学研究证明针对乳头状瘤病毒抗原的中和抗体的产生可抑制同源病毒的感染。由于不能在体外培养乳头状瘤病毒而使有效的人乳头状瘤病毒疫苗的进展缓慢。尤其是由于缺少合适的用于直接研究HPV的动物宿主而使有效的HPV疫苗进展缓慢。

抗体对乳头状瘤病毒的中和是类型特异性的并且依赖于病毒表面组成性的表位。

乳头状瘤病毒是小的(50-60nm)，非包被的，二十面体DNA病毒，它编码早期和晚期基因。病毒基因组的开放读码框(ORF)被称为E1到E7和L1到L2，其中“E”指早期而“L”指晚期。L1和L2编码病毒壳体蛋白。E1～E3和E5～E7与病毒复制和转化功能相关。

L1蛋白是主要的含壳蛋白，分子量为55-60K。L2蛋白是次要的含壳蛋白，它预期的分子量约是55K而聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量是75～100K。电子显微镜和免疫学数据提示大多数L2蛋白位于L1蛋白的内部。L2蛋白在不同的乳头状瘤病毒中是高度保守的，特别是C末端的10个碱性氨基酸。在不同的乳头状瘤病毒中L1ORF是高度保守的。

L1和L2基因己被用于产生可有效用于预防以及治疗乳头状瘤病毒感染的重组蛋白质。Zhou等将HPV类型16的L1和L2基因克隆入痘苗病毒载体并用重组载体感染CV-1哺乳动物细胞以产生病毒样(Virus-like)颗粒(VLP)。这些研究表明HPV类型16L1和L2蛋白在上皮细胞中的表达对VLP的装配是必需的也是充分的。L1蛋白单独表达或L2蛋白单独表达或者用含L1和L2基因的单个重组痘苗病毒载体两次感染细胞都不能产生颗粒。

细菌来源的重组牛乳头状瘤病毒L1和L2已有生产。针对重组细菌蛋白的中和血清与天然病毒有低水平的交叉反应，主要是因为天然和细菌来源的蛋白在构型上不同。

已用表达HPV16L1或HPV16L2ORF的重组杆状病毒感染昆虫SF9细胞并且产生了重组的L1和L2蛋白。Western印迹分析表明杆状病毒来源的L1和L2蛋白与抗HPV16的抗体反应。也已证明可用重组啤酒糖酵母菌株生产HPV16L1和HPV16L2蛋白。

因为细胞毒T淋巴细胞(CTL)在小鼠和人中都能识别来源自保守的内部病毒蛋白的表位并且被认为对针对病毒的反应是重要的，因此努力开发对不同病毒株可提供异种保护的CTL疫苗。

已知当其T细胞受体识别了与MHCI类分子相关的病毒多肽时，CD₈⁺CTL即可杀死病毒感染的细胞。这些多肽源自内源合成的病毒性蛋白质，而不管这些蛋白质在病毒内的定位或功能如何。因此，CTL通过识别保守的病毒性蛋白质的表位来提供毒株间的交叉保护作用。当MHCI类分子相关而被CTL识别的多肽源自那些位于或穿过细胞质或内质网的蛋白质。因此，一般说来，进入内体(endosomal)处理过程的外源蛋白(如MHCII类分子呈递的抗原的事情)，不能有效引起CD8+CTL反应。