[发明专利]含有卤代过氧化物酶的酶促抗微生物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及酶促抗微生物组合物及其应用。更具体地说，涉及含有钒卤代过氧化物酶(Vanadium haloperoxidase)，过氧化氢源和卤化物源的酶促抗微生物组合物。本发明还涉及采用重组DNA技术生产钒卤代过氧化物酶，该盐可用于酶促抗微生物组合物中。

现有技术背景

各种酶促抗微生物组合物是本领域内已知的。例如，WO-A-94/04217公开了稳定的牙膏组合物，该组合物能够产生抗微生物有效浓度的低硫氰酸离子(OSCN^-)。该组合物含有产生过氧化氢的氧化还原酶和能够将硫氰酸盐离子氧化为抗微生物的低硫氰酸离子(OSCN^-)的过氧化物酶，所说的硫氰酸盐离子通常存在于唾液中。合适的过氧化物酶包括乳过氧化物酶，髓过氧化物酶，唾液过氧化物酶和氯过氧化物酶。

在EP-A-500387(Exoxemis)也公开了含有卤代过氧化物酶的酶促抗微生物组合物。该文献描述了在过氧化物和卤化物存在下卤代过氧化物酶选择性地结合到靶微生物上并抑制其生长。EP-A-500387介绍的合适的卤代过氧化物酶是髓过氧化物酶(MEP)，嗜酸性粒细胞(EPO)，乳过氧化物酶(LPO)，和氯过氧化物酶(CPO)。报道了就卤代过氧化物酶的稳定性和功能而言卤化物与过氧化氢的比例是关键因素。在非常低的比例时，过氧化氢可以抑制卤代过氧化物酶的功能，而在非常高的比例时，卤化物可以阻碍酶促反应。该比例可以在一个宽范围内变化，但是优选的是保持在约50以上。

由于存在过氧化氢的不希望有的副反应，在该抗微生物组合物中实际的过氧化氢浓度比预期的要低。因此，本发明人发现在该抗微生物组合物中使用高起始浓度的过氧化氢以及常规量的卤化物可能更令人满意。

再者，需要一种与已知酶促抗微生物组合物的抗菌活性谱不同的酶促抗微生物组合物。优选地，该组合物应该具有抗击难于抵抗的微生物例如粪链球菌的抗菌活性。在其它环境下，还能够抗击非致病微生物也是所期望的，因为这些微生物可以引起食品的腐败。

因此本发明的目的是提供一种酶促抗微生物组合物，该组合物克服了上面所说的一种或多种缺点。

现在我们惊奇地发现使用钒卤代过氧化物酶可以配制特别有效的酶促抗微生物组合物。

上面介绍的现有技术包括用于抗微生物组合物中的各种各样卤代过氧化物酶，但是至今为止没有特别注意到钒卤代过氧化物酶类。

钒卤代过氧化物酶类不同于其它的卤代过氧化物酶，不同点在于这些酶的辅基具有类似于钒酸盐(钒V)的结构特征，而其它的卤代过氧化物酶是血红素过氧化物酶。

本发明的进一步的目的是将编码一种钒卤代过氧化物酶的基因进行克隆并且测定其序列以便其在其它便于生长的微生物中进行表达，以及利用重组DNA技术提高该酶的产量。

在天然海藻的表面发现了一些钒溴过氧化物酶(Wever et al.，1991)。在海水中的完整植株中钒溴过氧化物酶易于受添加物质的影响并且通过加入过氧化氢能够释放HOBr。尚没有确立该酶的作用，但是在海水中形成高氧化性的HOBr可能是作为植物阻碍微生物或真菌在其表面上生长的防御系统的一部分。

在从结节囊叶藻中发现非血红素钒溴过氧化物酶之后，证明了大量的海藻品种也含有这些酶。特别是，已经对从结节囊叶藻中发现的溴过氧化物酶进行了广泛的研究和定性(作为评论，见参考文献)。这些酶的辅基具有类似于钒酸盐(钒V)的结构特征。这些酶的催化机理是：过氧化物酶与该酶发生反应以形成过氧化氢-酶复合物，之后溴化物和一个质子与该复合物发生反应以形成一个酶-HOBr复合物。已经证明(De Boer et al.，1988)该复合物衰变形成酶和HOBr。还证明这些钒溴过氧化物酶(De Boer et al.，1988)在水和有机介质中具有操作上的高度稳定性。例如，在周转条件下三星期内这些酶是稳定的并且在有机溶剂例如丙酮，甲醇，乙醇(含量高达60％)和1-丙醇中可储存一个月以上的时间，而不丧失活性。但是，这些酶有不利的一面，即在实际应用时必须有溴化物的存在或加入，将编码海藻的溴过氧化物酶的基因克隆以及测定其氨基酸序列的尝试没有取得成功。

由于其遗传不稳定性和其低最适PH为2.75(J.R.Kanofsky，1984)(这些特性严重限制了其应用)现存的已知来自烟色卡尔黑酶的含有血红素的氯过氧化物酶几乎不适合于制备酶促抗微生物组合物，类似争论阻碍了来自人白血细胞的髓过氧化物酶(MPO)的应用，该酶也能产生HOCl(A.R.J.Bakkenist et al.，1980)。