[发明专利]人细胞色素P450系列转基因细胞株

说明书

本发明属分子生物学、细胞学范畴。

适用于药品、化妆品、食品添加剂、农药、化工产品、毒素等环境致癌物的代谢和遗传毒理学检测及研究。

目前国内外主要应用遗传毒理短期试验技术检测化学物质的致突变性、致癌性，由于大多数化学致突变物/致癌物需经体内细胞色素P450(简称CYP)代谢活化才能产生遗传毒理作用，而传统所用的建株细胞绝大多数不能表达CYP，因此必需在细胞外添加啮齿动物或其它来源的肝微粒体酶系或辅助细胞以达到理想的活化。这种设计与体内前致癌物在细胞内进行活化的过程正好相反，由于终致癌物在进入细胞时遭遇胞浆膜屏障且终致癌物半寿期一般都很短，此外，由于所用的啮齿动物的CYP与人类CYP有着较大的不同，因而影响了研究结果的可信度。

当前国外主要采用DNA重组技术，建立cDNA文库，在获得人CYP基因的表达克隆后，导入建株细胞中表达，应用于药理学、遗传毒理学的检测和研究，但存在着实验周期长，工作量大，细胞表达状态不稳定、所用的靶细胞不适合于我国的药理学、毒理学检测规定等缺点，且国外已商品化的产品价格也较高，难于在国内推广应用。

本发明建立的一系列稳定表达人CYP的转基因细胞株，应用于遗传毒理短期试验，可使有关致癌物的代谢活化和毒理终点测定在同一细胞内进行，进一步提高了实验的灵敏度和可信度；而且使选用较低剂量、较长时间暴露、检测化学致癌物的遗传毒性成为可能；建立一系列人CYP转基因细胞系，可为不同CYP同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具。

本发明采用下述技术方案：

(1)人CYP cDNA的克隆和鉴定：

以手术切除的人肝细胞标本及人羊膜FL细胞为起始材料，抽提总RNA，经设计的特定引物RT-PCR获得cDNA后，SouthernBlot杂交，初步对该cDNA片段进行分析和鉴定，将该cDNA片段克隆至质粒pGEM-3Z中进行序列分析和酶切图谱分析，以证实获得的基因无误。

(2)真核细胞表达重组体的构建和鉴定：

将克隆入重组质粒中的CYP cDNA片段用限制性内切酶切下，在电泳胶上分离回收，亚克隆入真核细胞表达载体pREP-9中，必要时酶切鉴定重组表达体上克隆片段的取向。

(3)真核细胞表达重组体导入培养细胞中表达和建株：

利用电穿孔转移技术将重组真核细胞表达载体导入合适的培养细胞中，用G418筛选出抗性细胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性测定技术鉴定，以获得长期稳定表达的细胞株。

(4)将该细胞系与遗传毒理学短期试验技术结合，建立新的检测前致突变物/致癌物的方法，用于遗传毒理学研究。

克隆表达的人CYP基因选择存在于肝脏且在药物和前致突变物/致癌物代谢中发挥重要作用的三大家族中的个体基因：CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4。基因表达的哺乳类靶细胞选用国家有关法规规定的细胞如中国仓鼠CHL、V79细胞，人羊膜FL细胞以及适合于该基因系列表达的其他一切细胞。

与现有技术相比，本发明进一步提高了研究结果的可信度和灵敏度，为人CYP个体同功酶的代谢功能研究提供非常有用的工具，促进和提高我国环境致癌物的监测及研究水平。本系列人CYP转基因细胞株，可应用于环境保护，监测、医药、化妆品、食品添加剂，日用化工产品和农药等方面的生产监测和管理，因而具有一定的经济效益。

在技术上，本发明首先采用RT-PCR技术克隆人CYP基因，克服了构建cDNA文库过程中的困难，大大减轻了工作量，节约了成本，缩短了实验周期，且应用国家有关法规规定的几株细胞作为转基因的靶细胞。实验结果表明：导入的基因能稳定表达半年以上。

本发明结合实施例作进一步说明：

实施例1：人CYP cDNA的克隆和鉴定

根据已发表的CYP cDNA序列，选择其5′端和编码区序列的3′端分别为两侧引物的起始端，两个PCR引物的5′末端分别含有限制性内切酶识别位点。

人肝组织取自手术切除的癌旁组织，总RNA按AGPC方法提取，经紫外分光光度计测定和甲醛变性胶电泳确定所获得的RNA纯度，浓度和完整性。