[发明专利]腈水化酶基因表达的调节基因

说明书

本发明涉及得自红球菌属细菌并编码能激活腈水化酶基因启动子的多肽的调节基因，含所述DNA的重组DNA，以及用所述重组的DNA转化的转化体。

由于反应在常温和常压下进行，转化程度高等原因，用腈水化酶(即水化腈成为酰胺的酶)生产酰胺的方法作为有工业价值的方法而得到应用。尤其是，已知红球菌属的细菌在其细胞中积累了显著数量的该酶，从而表现出高催化活性(见日本专利公开No.4873/1992和日本特许公开的Nos 91189/1987，470/1990和84198/1990)。

与所述的传统方法相比，由于可加工细菌以使其含有多拷贝的相同基因，从而期望使用经基因重组克隆的腈水化酶的方法可以使细菌水化腈的催化能力有极大的改善。经基因重组技术如位点特异性诱变，随机诱变等还可使酶得到进一步的提高。已经从N-774(日本特许公开No.119778/1990)和J-1(日本特许公开No.211379/1992)得到了源于红球菌属的腈水化酶。可以将来自N-774的腈水化酶基因成功地插入红球菌属-E.coli杂交质粒载体(日本特许公开No.64589/1993)，而且当导入红球菌属的细菌中后，可得到高活性(日本特许公开No.68566/1993)。另一方面，还没有关于在红球菌属的细菌中，表达源于玫瑰色红球菌J-1的腈水化酶基因的报道，尽管其腈水化酶活性高于N-774。

本发明的发明人发现不能表达源于J-1的基因是由于缺少调节基因的DNA片段而造成的，所述的调节基因涉及腈水化酶基因启动子的功能。因此，他们在J-1的总DNA中找到了调节基因，并发现该基因位于腈水化酶结构基因的上游。成功地用该基因在红球菌属的转化体中高水平表达腈水化酶。

即，本发明涉及源于红球菌属细菌并编码能激活腈水化酶基因启动子之多肽的调节基因，含有所述DNA的重组DNA，以及用所述重组DNA转化的转化体。

图1：表示重组质粒pHJK18的构建过程。

图2：表示重组质粒pHJK19的构建过程。

下文将详细描述本发明。经下列步骤实施本发明。

(1)制备染色体DNA：

从玫瑰色红球菌J-1中分离总DNA。

(2)构建DNA文库：

从含J-1腈水化酶基因的质粒中切出靶腈水化酶基因片段，然后用放射性同位素标记。用该片段作为探针。

用限制酶裂解步骤(1)中得到的总DNA，然后用上述制备的探针进行Southern杂交(Southern E.M.，J.Mol.Biol.98，503(1975))，将含靶基因的检测过的DNA片段插入质粒载体puc19中以制备文库。

(3)制备转化体并筛选重组DNA：

用步骤(2)中构建的重组DNA文库从携带靶重组DNA的菌落制备转化体，所述菌落用步骤(2)中得到的探针经菌落杂交(R.BruceWallace et al.，Nuc.Acids Res.9，879(1981))进行筛选。使杂交的菌落经Southern杂交以证实靶重组DNA的存在。

(4)分离并纯化重组质粒，构建限制酶图谱：

从步骤(3)中得到的转化体中分离重组质粒。该质粒称为质粒pNHU10。用不同限制酶对其进行裂解，然后经电泳分析以得到限制酶图谱。

(5)通过将含有调节基因和腈水化酶基因的片段插入能在红球菌属中复制的质粒载体中而构建重组质粒：

通过将步骤(4)中得到的质粒和含有源于J-1之腈水化酶基因的质粒pNHJ10H插入杂交质粒载体pK4中而构建各携带一调节基因和含腈水化酶基因片段的重组质粒pHK18和pHK19。

(6)转化红球菌属的细菌并由转化体生产腈水化酶：

将步骤(5)中得到的质粒导入红球菌属的细菌中，然后证实转化体中腈水化酶的表达。

(7)缺失—质粒和腈水化酶活性：

缺失步骤(5)得到的质粒的不同区域，从而制备缺失—质粒。用所得的缺失—质粒鉴别对于腈水化酶表达所必需的区域。由此鉴定腈水化酶表达所必需的，而不是编码腈水化酶的区域。

(8)核苷酸测序：

确定步骤(7)中所鉴定的区域的核苷酸序列。