[发明专利]用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法

说明书

本发明属于以根癌农杆菌转化植物的方法，具体地说是涉及一种用诱导性信号分子诱导根癌农杆菌介导外源基因转化水稻的方法。

随着植物基因工程的兴起，运用基因工程技术改变常规育种手段难以奏效的某些经济作物已成为可能。目前应用最广泛而有效的转化系统是以Ti质粒为载体的根癌农杆菌(Agrobaeterium tumefaciens以下简称农杆菌)介导法。据统计，已有大约23个科的60多种植物获得转基因植株。其中80％的转基因植株是运用农杆菌Ti质粒或Ri质粒为载体转化得到的。但是，农杆菌对于大多数单子叶植物不敏感，特别是水稻等重要禾谷类作物，很难运用杆菌介导法获得转化植株。有的科学家甚至认为农杆菌介导转化单子叶植物是无效的。因此，如何建立一种高效而简便的转化系统来转化单子叶经济作物已成为当今分子生物学界，特别是植物基因工程技术领域渴望解决的重大课题。

水稻是世界上主要的粮食作物之一，随着世界人口的增长，人类对稻米的需求将不断增大，然而，当今全球性的生态环境恶化和不利的气候条件正侵蚀的稻属种内和种间的遗传多样性，有可能使许多有价值的稻属(种)资源灭绝，给传统的水稻育种工作带来难以解决的问题，这种状况将威胁着水稻生产，导致粮食短缺，尤其是在人口迅猛增长的亚洲地区。所以，如何借助现代基因工程技术建立一种简便而高效的转化系统，以便将优良基因导入栽培水稻，从而培育出优良水稻品种，提高水稻产量，这是目前水稻育种中亟待解决的重要课题。

本发明的目的是建立一种以农杆菌介导外源基因转化水稻的方法，以解决目前水稻育种中所面临的难题。

本发明是在我们发现水稻中存在诱导农杆菌vir区基因表达的信号分子的基础上做出的。在此之前，多数科学家认为单子叶植物之所以难以被农杆菌转化，是因为单子叶植物不能产生使农杆菌趋化运动及诱导vir区基因表达的诱导性信号分子。为了证实单子叶植物中是否存在这种诱导性信号分子，并以此探索一种以农杆菌转化水稻的方法，我们对水稻各个发育时期的代谢进行提取，以农杆菌vir∶∶lacZ融合基因系统进行检测和筛选，发现并确定在幼穗分化期至抽穗扬花期的水稻茎叶抽提物中含有二种高效诱导农杆菌vir区基因表达的信号分子。这两种诱导性信号分子与乙酰丁香酮(AS)这一经典的农杆菌诱导物的诱导效果极为相似，而且这两种信号分子对vir区基因的协同诱导效果比AS单独诱导作用要强。经过红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振、异核多量子相干相关谱、异核多键相关谱等波谱分析，确定这两种诱导性信号分子的化学结构分别为5，7，4＇-三羟基-3＇，5＇-二甲氧基黄酮(5，7，4＇-trihydroxy-3＇，5＇-dimethoxy以下简称F1)和5，4＇-二羟基-3＇，5＇-二甲氧基-7-(β-D葡萄糖基)黄酮[5，4＇-dihydroxy-3＇，5＇-dimethoxy-7-(β-D-glucosyloxy)-flavone，以下简称F2]，这两种信号分子的化学结构式如下：

从上述结构式可看出，信号分子F1和F2具备了Spencer等所分析的高效诱导vir区基因表达的酚类化合物的结构特征(Spencer，P．A，et al．，1990，Phytochemistry，29：378～3788)：3＇或5＇位上含甲氧基，1＇位上具极性侧链；侧链上含一个羰基，与苯环隔1～3个碳原子；羰基与苯环间有一个双键；4＇位上含羟基。

上述信号分子F1和F2可以从水稻幼穗分化期至抽穗扬花期的茎叶提取得到。具体方法是：取该生长期的水稻新鲜茎叶，切碎匀浆，按每公斤加入0．5～6升70～95％的乙醇，搅拌，浸取3～10天，过滤除渣，将滤液浓缩(一般采用减压浓缩，至每公斤水稻茎叶50mL)；还可以将第一次过滤的滤渣再按上述步骤浸取一次，将所得滤液与第一次滤液合并一起浓缩；浓缩液用石油醚∶乙醚=(0．3∶0．7)～(0．7∶0．3)(体积比)萃取，去萃取液，余液(水相部分)再经乙酸乙酯萃取，去水相部分，取乙酸乙酯相部分过60～200目硅胶柱；然后分别用丙酮∶石油醚=(15∶85)～(70∶30)(体积比)洗脱得A洗脱液和用丙酮∶石油醚=(75∶25)～(90∶10)(体积比)洗脱得B洗脱液，将A、B两洗脱液分别经氯仿∶甲醇=(9∶1)～(5∶5)(体积比)重结晶即得信号分子F1和F2，再经60℃干燥得纯品。

本发明的方法是用含有诱导性信号分子F1、F2和AS的培养液诱导培养携带有外源基因重组质粒的农杆菌，得到诱导菌液，再将该诱导菌液与经致伤处理的水稻幼苗一起在旋转磁场中共培养，即可获得被转化的转基因水稻幼苗。

本发明方法一般包括以下步骤：