[发明专利]微生物同步发酵生产长链α,ω-二羧酸的方法

说明书

本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸，尤其是发酵正十二烷(nC₁₂)，高产十二碳二元酸(DC₁₂)的方法。

长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂等的重要原料。DC₁₂是合成高级尼龙工程塑料尼龙12，尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶的重要原料。尼龙12是目前国际上开发出来碳链最长，质量最好，价格最高，年产量达到5万吨的高级尼龙工程塑料。尼经12是1966年由德国HüLs公司和瑞士Emser公司投产，后来法国、日本、美国也均有生产，他们多采用纯化学方法，以丁二烯为原料，在高温、高压，催化剂条件下，经过七个复杂的反应步骤生产的，步骤多，收率低，成本高，我国目前还不能生产。如果以DC₁₂为原料合成尼龙12，只需经过四个反应步骤，条件温和，步骤少，收率高，成本低，是竞争力最强的的合成方法。而DC₁₂自然界中不存在，化工上又难以合成，因此，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下转化石油中的正十二烷，生产DC₁₂，开辟DC₁₂的新来源，为尼龙12、尼龙1212和服装用高档热熔胶的工业生产提供物美价廉的重要原料。

在专利文献中，有从正十二烷发酵生产十二碳二元酸的实验例，但都是实验室水平。在US 4339536中，有生产DC₁₂的实验例，但只达到45g/L水平，在CN1071951A中，其实验例2是异步发酵生产DC₁₂，在3L自动控制罐内DC₁₂达到102g/L，转化率为75％。

本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH-2-48，是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980)为出发菌株，通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C₁₁-C₁₇的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十二烷，高产出地生产相应链长的二元酸。热带假丝酵母UH-2-48(以下简称UH-2-48)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.0239。

本发明的种子培养基：(1)10Be′糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)10Be′糖度的麦芽汁液体培养基；(3)烷烃种子培养基包含：KH₂PO₄6-12g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，玉米浆3-8g/L尿素3-6g/L，重蜡40-70ml/L，自来水配制，自然PH。

培养种子的过程为：取一接种环UH-2-48酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7ml培养基，灭菌后放成斜面)，于29-30℃培养40小时。取一支上述培养好的UH-2-48菌种全部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于29-30℃ 220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的UH-2-48菌种全部刮入装有500mL培养基的5000ml三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。