[发明专利]核糖核酸酶抑制因子在制备肿瘤生长抑制药物中的应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质。

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor简称RI)是一种已知物质，该物质是由Blabckburn P等人，最先提纯的，其提纯和鉴定的方法，曾在J.Biol.Chem 1977，252：5904-5910及1979，254：11154-11159上公开发表。该核糖核酸酶抑制因子，它能与核糖核酸酶(Ribonclease简称RNase)结合并抑制其活力从而具有保护mRNA和rRNA的作用。因此人们将它用作体外实验中保护mRNA的一种试剂。

本发明的目的在于提供一种利用核糖核酸酶抑制因子易与血管形成因子(angiogenin)结合的性质将它作为肿瘤生长抑制剂。

本发明的目的可通过以下措施来实现：核糖核酸酶抑制因子在制备肿瘤生长抑制药物中的应用，其特征在于：制备方法如下：采用人胎盘经破碎制成匀浆液，将上清液盐析后置于磷酸盐缓冲溶液中，经透析和DEAE离子交换层析，得到核糖核酸酶抑制因子的制品，上述过程均在4℃以下进行，其比活为700～830单位/毫克。将上述方法制备的核糖核酸酶抑制因子的制品透析后加入到Sepharose-RNase亲合层析柱上，洗脱去掉非专一性吸附的杂蛋白，再用醋酸盐缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰，即为核糖核酸酶抑制因子的纯品，其比活为30，000～50，000单位/毫克。核糖核酸抑制因子在制备肿瘤生长抑制药物中的应用，其特征在于：采用上述方法制备的产物，经灭菌、分装制备成针剂对肿瘤患者进行皮下注射。

本发明所采用的核糖核酸酶抑制因子是一种糖蛋白，分子量约50KDa，广泛存在于细胞的可溶性部分。它能与核糖核酸酶结合成复合物，使细胞中的核糖核酸酶主要以潜伏形式存在。在核糖核酸酶抑制因子的结构中含有30个游离的巯基。巯基是核糖核酸酶抑制因子的活性必需集团，巯基的氧化会导致核糖核酸酶抑制因子的失活。核糖核酸酶抑制因子还可以与血管形成因子结合，其结合力是与核糖核酸酶结合的100倍，由此抑制血管的生成。新血管的形成在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用。实体瘤通过分泌血管形成因子而刺激血管的形成，如果停止血液供应，肿瘤不仅停止生长，而且也不能向循环系统释放癌细胞而转移。

本发明采用的人胎盘核糖核酸酶抑制因子(简称PRI)的制备方法是在Blockburn方法[Misra，T.K.and Apirion.D.(1979).J.Biol.Chem，254：11154-11159.]的基础上加以改进的。改进后的流程如下：

1、破碎胎盘采用新鲜的人胎盘，用含0.25M蔗糖的Tris.HCl(pH7.5)缓冲液洗去血，剥去膜和结缔组织，剪碎，用高速匀浆器制备匀浆。

2、上清液盐析  将匀浆液离心(16，000g，30分钟)取上清液，加固体硫酸铵至35％饱和度，搅拌1小时。16，000g离心30分钟，弃去沉淀，上清液中继续加入固体硫酸铵至60％饱和度搅拌1小时。离心(16，000g，30分钟)弃去上清液，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中(pH6.4)为核糖核酸酶抑制因子的粗制品。

3、用透析和DEAE离子交换层析提纯核糖核酸酶抑制因子在磷酸盐缓冲溶液中(pH6.4)透析过夜后加入到予先用缓冲液平衡好的DEAE-阴离子交换柱上，用同样的缓冲液淋洗后用0.35M氯化钠洗脱。最好用0.15～0.5M氯化钠梯度洗脱。收集，测各管的A280吸收，并测活性，得到比活为700～830单位/毫克的核糖核酸酶抑制因子制品。

4、用亲合层析提纯：合并活性峰，透析后加入到Sepharose-RNase亲合层析柱上，淋洗去掉非专一性吸附的杂蛋白，加洗脱液(pH5.0含3M NaCl和15％甘油的0.1M NaAc-HAc缓冲液)继续洗脱，收集蛋白峰，即为核糖核酸酶抑制因子的纯品，并进行核糖核酸抑制因子活力测定。

以上的分离纯化过程均在4℃以下进行。

5、灭菌、分装  将经上述提纯后的核糖核酸酶抑制因子用微孔滤膜过滤灭菌、分装制得注射用针剂。分装于安瓿内的药品最好在冷冻干燥后贮存。

制得的核糖核酸酶抑制因子活性测定采用比色法(分光光度法)。测定加入核糖核酸酶抑制因子后核糖核酸酶水解RNA能力的下降。所得核糖核酸酶抑制因子比活为30,000-50,000u／mg。核糖核酸酶抑制因子的鉴定：采用电泳鉴定即用不连续SDS-PAGE电泳，分离胶浓度10％经鉴定亲合层析后是一条带。DEAE层析后蛋白浓度为2.5～3.0毫克／毫升。