[发明专利]超氧化物歧化酶－4

说明书

本发明涉及新鉴定的多核苷酸，由此多核苷酸编码的多肽，此多核苷酸和多肽的应用，以及此多核苷酸和多肽的生产。更精确地说，本发明的多肽为超氧化物歧化酶(SOD-4)。

氧和体内诸如蛋白质，碳水化合物，脂类和核酸的生化化合物之间的反应需要很强的热动力学驱动力。如果这种反应完成，水，二氧化碳和大量废物将作为终产物形成，同时释放大量能量。生物化合物的氧化是有机体能量的来源。这些反应自发进行，但由于反应屏障的原因而非常缓慢。中间代谢中的酶可以克服这些屏障，与氧的最终反应发生在线粒体，在线粒体内氧原子被四个电子还原成水而不会释放出任何中间产物。此反应由电子传递链中的细胞色素氧化酶复合物完成，能量以ATP的形成被捕获。

但是，从氧原子到水的直接四步还原是唯一的，当氧原子自发反应或由酶催化进行时，此过程有时将被迫反应一步。一系列被称为超氧化物基团(O₂^-)，过氧化氢(H₂O₂)，和羟基基团(OH^-)的有反应活性和毒性的中间代谢物将形成。

其中的两个，O₂^-和OH^-，具有单个未成对电子，因此被称为自由基。估计体内氧消耗的一小部分将形成有毒的还原中间产物。氧的毒性作用主要归因于这些中间产物的活动。

氧原子自身与生化化合物的反应缓慢，通常毒性反应是由产生升高的氧基团的过程起始的，这些毒性反应可直接破坏生化化合物或启动有氧的链式反应。

有些化合物与氧原子自发发生反应，即，这些化合物自氧化。几乎所有的自氧化都会导致有毒氧还原中间产物的形成。肾上腺素，邻苯三酚和几个其它化合物的自氧化导致超氧化物自由基的形成。当离子化的基团穿过含氧的水样溶液时，发现超氧化物基团是含量最高的基团。如此形成的有毒氧还原产物对细胞的杀灭能力具有十分重要的意义，但这些产物还可能导致周围组织的破坏。

过氧化氢总是在超氧化物通过歧化反应途径形成时形成。大多数体内的氧化酶直接将氧还原成过氧化氢。

生活在有氧环境中的有机体被迫进化出大量的保护性机制以抵抗有毒氧还原代谢物。这些保护性因子包括歧化超氧化物基团的超氧化物歧化酶(SOD)，在哺乳动物细胞和组织中SOD的数量相当稳定。这些酶中最知名的是CuZnSOD,CuZnSOD是一个含两个铜原子和两个锌原子的分子量为33,000的二聚体。CuZnSOD存在于细胞质和线粒体的膜间间隙。MnSOD是一个含四个锰原子的分子量为85,000的四聚体，主要位于线粒体的基质中。直到最近，人们还认为细胞外液体中缺乏SOD活性。但是，最近U.S.专利5,248,603披露胞外液(例如，血浆，淋巴液，滑液和脑脊髓液)中存在一种叫做EC-SOD的超氧化物歧化酶。

重组的人野生型CuZuSOD和其热稳定的双突变体(Cys-6-----Ala,Cys-111----Ser)已经在2.5A的分辨率上测定分析了其晶体结构。在一个锌结合位点上存在一个螺旋偶极相互作用，14个残基形成两个或多个结构保守的侧链以保证氢原子的结合，这些结构对活性位点结构，环的形成和Cys-111----Ser突变造成的稳定性提高看来是至关重要的。Parge,H.E.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:6109-13(1992)。

CuZnSOD基因的突变发生在致命的神经退化性紊乱-家族性半身肌萎缩硬化的患者身上。CuZnSOD编码区的筛选揭示外显子1内的Ala4-Val突变是最经常发生的，在外显子2,4和5内鉴定出了突变，但在外显子3形成的活性位点区没有发现突变体。因此，缺陷型CuZnSOD与运动神经元死亡有关，也有助于了解或治疗家族性半身肌萎缩硬化。本发明的多肽，SOD-4，在结构和功能上与CuZnSOD有关。

日本专利4327541披露了一种用于器官移植后免疫反应的治疗药物，含有通过基因重组获得的人CuZnSOD的活性物质。

日本专利4312533披露了一种治疗大脑局部出血组合物，它包括重组的人CuZnSOD，抑制与局部出血相伴的延迟性神经坏死。

日本专利4248984披露了一种在血液中比SOD具有更长半寿期的超氧化物歧化酶衍生物，因此有助于治疗各种疾病。

欧洲专利499621披露了一种纯化重组CuZnSOD的方法和一种提高此多肽的B型同工类似物产量的方法。