[发明专利]重组p53腺病毒方法和组合物

说明书

                    发明的背景

本发明总地涉及重组技术领域。在某些方面，涉及简化而有效的产生重组腺病毒的方法。在其他方面，提供包括p53腺病毒构建体的新组合物及其制备方法，包括恢复p53功能及抑制有异常p53之细胞生长的方法。

                     相关技术的描述

目前治疗肿瘤的方法，包括放射治疗、外科治疗和化学药物治疗均只有有限的效果。在美国每年仅死于肺癌的就有14万人以上。近年，按年令组调查的妇女肺癌死亡率己超过了乳腺癌死亡率。虽然实施戒烟计划后已减少了吸烟的风行，但预计进入21世纪肺癌死亡率仍将居高不下。合理的开发肺癌的新疗法探取决于在分子水平上对肺癌生物学的了解。

现已证实，各种不同的肿瘤至少部分是由于导致一种或多种基因的过表达、或异常或突变基因表达的遗传异常引起的。例如，在许多情况下，已知“癌基因”的表达将导致肿瘤发生。“癌基因”是从遗传上改变了的基因，其突变的表达产物以某种方式破坏正常细胞的功能或调控(Spandidos et al.，1989)。

已发现迄今研究的大多数癌基因都是突变而成为被“活化的”，所说的突变常常是发生在正常细胞基因即“原癌基因”之编码区中的点突变，从而导致被表达之蛋白质产物中的氨基酸取代。这种改变了的表达产物表现有参于恶性生长过强的异常生物学功能(Travali et al.，1990)。可用各种手段，例如化学诱变或电离幅射引起根本性突变。现已鉴定了包括ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、iun和abl在内的许多癌基因和癌基因家族，并在不同程度上确定了它们的性质(Travali et al.，1990；Bishop，1987)。

在正常细胞生长期间，认为生长促进性原癌基因受到生长约束性肿瘤抑制基因的抗衡。有几种因素可使这两种力量失衡，导致肿瘤生成状态。其中一种因素是肿瘤抑制基因的突变(Weinbery，1991)。

一种重要的肿瘤抑制基因是编码细胞蛋白质p53的基因，所说的p53是分子量53KD的控制细胞增殖的核内磷蛋白。引起定位于染色体17p上应该基因及某位基因丢失的突变是在人类恶性肿瘤中鉴定的最常见的改变。p53蛋白质在进化过程中是高度保守的，并且可在大多数正常组织中表达。已证明野生型53参于控制细胞周期(Mercer，1992)。转录调节(Fields et al.，1990，和Mietz et al.，1992)、DNA复制(Wilcoch and Lane，1991和Bargonetti et al.，1991)及诱导编程性细胞死亡(Yonish-Rouach et al.，1991和Shaw et al.，1992)。

各种突变p53等位基因是已知的，其中单个碱基取代导致具有相当不同之生长调节性质的蛋白质的合成，最终导致肿瘤发生(Hollstein et al.，1991)。事实上，已发现p53基因是常见的人肿瘤中最常发生突变的基因(Hollstein et al.，1991；Weinberg，1991)，并且与那些同吸烟有关的肿瘤有着特殊的联系(Hollstein et al.，1991；Zalcut-Houri et al.，1985)。也已报导p53在乳腺癌中的过表达(Casey et al.，1991)。

对肿瘤进行基因治疗的一个最具挑战性的方面涉及利用肿瘤抑制基因，如p53。已报导了将野生型p53转染到某些类型的乳腺和肺肿瘤细胞中可恢复细胞系中的生长抑制性控制(Casey etal.，1991；Takahasi et al.，1992)。虽然DNA转染并不是将DNA导入病人细胞中的可行手段，但这些结果可以证明，如果能建立一种输送p53基因的改良方法，则向带有突变之p53基因的肿瘤细胞提供野生型p53可能是一种有效的治疗方法。

近年已研究并开发了可应用于肿瘤抑制之基因治疗的基因释放系统。鉴于病毒在感染真实活细胞(即一种病毒遗传材料本身被转移的过程)中的效力，所以对基于病毒的基因转移载体特别感兴趣。在这方面，例如在产生用于输送各种基因的工程化逆转录病毒载体中已取得了某些进展。然而，与使用逆转录病毒载体进行基因治疗相联系的主要问题是因为它们的感染性要取决于靶细胞上逆转录病基受体的可利用性、它们难于浓缩和纯化、以及它们只能有效地整合到复制细胞中。