[发明专利]降低了吸附能力以及增加了水解能力的枯草杆菌蛋白酶BPN变体

说明书

技术领域

本发明涉及用于各种清洁组合物中的新型酶变体，以及编码所述酶变体的基因。

背景

酶构成了最大类的天然存在的蛋白质。各类酶通常催化(使未被耗尽的反应加速进行)不同类型的化学反应。已经知道称为蛋白酶的一类酶具有水解(通过在被裂解化学键的任一侧吸取水分子的H和OH而将一种化合物分裂为二种或多种较简单化合物)其他蛋白质的能力。通过将天然存在的和以蛋白质工程技术制造的蛋白酶作为添加剂掺入到洗衣用去污制剂中，这种水解蛋白质的能力已发挥了其优点。衣服上的许多污渍是蛋白质的并且有广泛特异的蛋白酶能从实质上更好地去除这些污渍。

但不幸的是，在自然的细菌环境中这些蛋白质的效率水平通常不会转变成相对的非天然洗涤环境。特别是，对于在酶的天然环境之外使用时并不一定能使蛋白质特性例如热稳定性，pH稳定性，氧化稳定性以及底物特异性达到最佳化。

蛋白酶的氨基酸序列决定着该蛋白酶的特性。依据氨基酸序列变化的位置，性质和/或量的大小，蛋白酶氨基酸序列的变化可在不同程度上改变酶的特性，或者甚至使酶失活。已采用几种方法用于在试图改善其特性中改变蛋白酶的野生型氨基酸序列，达到增加蛋白质在洗涤环境中的效率。这些方法包括改变氨基酸序列以便在十分不利的条件下提高其热稳定性以及改善其氧化稳定性。

尽管本领域内描述了各种方法，但仍需要适用于清洁各种表面的新的有效的蛋白酶变体。

发明目的

本发明的一个目的是提供枯草杆菌蛋白酶酶变体，相对于野生型酶该酶变体改善了水解能力。

本发明还有一个目的是提供含有这种枯草杆菌蛋白酶酶变体的清洁组合物。

发明概要

本发明涉及枯草杆菌蛋白酶BPN′变体，它在特异性鉴别的位置上至少含有一、二或三个氨基酸位置上具有不同于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸(即替代)，从而与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比，所述BPN′变体增加了对不溶性底物的吸附作用，增加了水解不溶性底物的能力。本发明还涉及编码所述枯草杆菌蛋白酶BPN′变体的基因。本发明还涉及含有所述枯草杆菌蛋白酶BPN′变体的用于清洁各种表面的组合物。

发明的描述

1.枯草杆菌蛋白酶变体

本发明涉及枯草杆菌蛋白酶，尤其是已通过将编码该酶的各个核苷酸序列进行突变，从而修饰该酶的氨基酸序列所得到的经过修饰的BPN′。与野生型枯草杆菌蛋白酶相比，本发明所述经过修饰的枯草杆菌蛋白酶(下文中称为“BPN′变体”)降低了对不溶性底物的吸附作用并且提高了对不溶性底物的水解作用。本发明还涉及编码所述BPN′变体的突变基因。

本发明的枯草杆菌蛋白酶属于称为蛋白酶的一类酶。蛋白酶是裂解肽键的催化剂。一种类型的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。由于在活性位点存在必需的丝氨酸残基这一事实而得以区分丝氨酸蛋白酶。

在文献中已详细地记载了酶水解可溶性底物的速度随酶浓度增加而加速的研究资料。因此对于表面结合的底物例如许多清洁应用中遇到的情况而言，水解速率随表面浓度增加而提高似乎是合情合理的。这种现象已得到证实(Brode，P.F.111和D.S.Rauch，LANGMUIR，“Subtilisin BPN′：Activity on an Immolbilized Substrate”，Vol.8，pp.1325-1329(1992))。事实上，对于不溶性底物，当酶的表面浓度变化时，发现水解速率对表面浓度的线性依赖性(Rubingh，D.N.和M.D.Bauer，“Catalysis of Hydrolysis byProteases at the Protein-Solution Interface，”inPolymer Solution，Blends And Interfaces，Ed.by I.Nodaand D.N.Rubingh，Elsevier，P.464(1992))。令人惊奇的是，当应用该原则寻找有更好清洁性能的变异蛋白酶时，我们没有发现具有更好吸附效能的酶。事实上，我们出人意料地确认了相反的情况：酶对底物的吸附作用降低了导致了对底物之水解作用的提高(即较好的清洁性能)。

虽然不拘泥于理论，但据信当将一种变异体与另一种相比较时，改善的清洁性能是由于酶吸附较少时结合紧密程度也较小，因而在待去除之不溶性蛋白质底物的表面上的移动性更大。在有差不多的酶溶液浓度时，这种移动性的提高足以超过任何优点，所述优点是因较高浓度的酶释放到表面上而提供的。