[发明专利]腐胺N-甲基转移酶，编码腐胺N-甲基转移酶的重组DNA分子，生物碱含量减少的转基因烟草植物

说明书

本发明的技术领域

本发明涉及高度纯化的腐胺N—甲基转移酶，其纯化的新方法和其反义和有义基因。特别是本发明涉及使用有意义和反义腐胺N—甲基转移酶基因生产烟碱水平在遗传上被改变的转基因烟草植物。该转基因植物在用于烟草工业的烤烟产品中是有用的。

本发明的背景

为了从烟草中去掉烟碱使用了各种各样的方法。然而这些方法中，大多数对烟碱没有足够的选择性。它们从烟草中去掉了其它成份，从而对其风味和香味产生了不利影响。而且，这些方法典型地较复杂和昂贵。

烟碱和生物合成的化合物一般通过一系列生化反应形成，其中每步反应由一种不同的酶催化。产生给定化合物的特定反应系列称作途径。抑制一种途径运转并因此抑制其终产物产量的一种方法是减少该途径中一种所需酶的量。如果该酶的丰度相对于该途径中的其它酶而言在正常情况下低得足以使该途径运转中的酶速度受到限制，那么该酶丰度的任何减少将以终产物的产量降低而反映出来。如果酶的相对丰度在正常情况下不限制速度，为了减少该途径的产量，可能必须减少它在细胞中的丰度使足以产生速度限制。同样地，如果酶的相对丰度限制速度，那么其丰度的任何增加将导致途径中终产物产量的增加。

烟碱首先在烟草植物的根部形成，随后运输到叶中，并在那里贮存起来(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，PP，233—234，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，PA(1972)。烟碱分子包含2个杂环：吡啶部分和吡咯烷部分，每个杂环来自不同的生化途径。烟碱的吡啶部分来自烟酸。烟碱的吡咯烷部分通过从腐胺到N—甲基腐胺然后到N—甲基二氢吡咯的途径来提供。在烟碱生物合成中必经的步骤是从腐胺形成N—甲基腐胺(Goodwin and Mercer，Introduction to Plant Biochemistry，PP.488—491，Pergamon Press，New York，(1983))。

腐胺向N—甲基腐胺的转化由腐胺N—甲基转移酶(“PMT”)催化，以S—腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。在烟草中为烟碱合成提供N—甲基二氢吡咯的途径中PMT表现为限速酶(Feth et al，“Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Actiuities of theNicotine Pathway”，Planta，168，PP.402—407(1986)；Wagner etal.，“The Regulaton of Enzyme Acttvitives of the NicotinePathway in Tobacco”，Physiol，Plant，68，PP.667—672(1986))。

对PMT的相当粗糙的制品(纯化30倍)已进行了有限的鉴定(Mizusaki et al.，“Phytochemical studies on Tobacco AlkaloidsXIV.The Occurrence and Proertes of Putrescine N—Methyltransferase in Tobacco Plants”，Plant Cell Physiol，12，PP.633—40(1971))。得到该制品的纯化步骤局限于从最初的提取物中进行硫酸铵沉淀和凝胶过滤色谱同上。

反义RNA技术使产生的植物特征为酶(或其它蛋白质)的水平比由该植物正常情况下所含的水平明显要低。通常情况下，编码靶酶的基因转录产生单链mRNA，然后由核糖体翻译产生靶酶。反义RNA分子是一种其核苷酸序列与靶mRNA分子某部分互补的RNA分子。因此，反义RNA分子与靶mRNA分子将进行互补碱基配对(杂交)，导致靶mRNA分子不能翻译，更易于降解，或两种情况都发生。从而使细胞对于由靶mRNA编码的特异性酶的生产能力受到抑制。