[发明专利]活细菌

说明书

本发明涉及含有干燥的停滞态微生物细胞的组合物的制备方法、所述组合物及由该组合物制备的活培养物。

活培养物的贮存是本领域中公认的难题。例如，美国专利3,897,307公开了：(ⅰ)使用抗坏血酸盐化合物和谷氨酸盐或天冬氨酸盐的组合物作为产乳酸细菌细胞的稳定剂；(ⅱ)使用某些糖类，特别是浓度为每亳升样品溶液25mg的肌醇，作为冰冻干燥所述细菌细胞时的低温防护剂。

Mugnier等人(Applied and Environmental Microbiology，1985，pp108-114)公开了使用多糖凝胶与某些营养物(如C_1-3和C_6-12化合物)组合作为冰冻干燥细菌细胞的基质。我们发现，形成凝胶的多糖在冰冻干燥时并不收缩。

Redway等人(Cryobiology，11：73-79，1974)考察了作为长期存活的冰冻干燥细菌的培养基的某些单糖(浓度最高为150mg/2ml样品)和有关的化合物。

我们现已发现，如果将微生物细胞悬浮于如下所限定的某些基质中，并在某些条件下干燥，则其短期存活率提高；如果将上述干燥体系贮存起来，并在如下所限定的某些条件下再水化，则微生物细胞的长期存活率提高。

我们还进一步意外地发现，悬浮有微生物细胞的基质的收缩并不导致短期存活率差。

本发明的第一方面提供了一种稳定化的干燥组合物，该组合物含有悬浮于收缩基质中的停滞态微生物细胞。

“稳定化”是指微生物细胞的降解减少(所述降解会导致可恢复的活细胞的损失)。

“停滞态”是指细胞不进行代谢、分裂或生长(但如进行适当处理就可恢复)。

“可恢复”是指细胞处于适当条件下时(即在进行再水化和有营养源时)能够生长和分裂。

“活细胞”是指细胞处于适当条件下时(即在进行再水化和有营养源时)能够生长和分裂。

“收缩”是指：

(1)基质已发生收缩，孔隙度变小，使低分子量扩散物几乎不能穿透基质，例如，基质在暴露于潮湿空气中时几乎不吸水；和/或

(2)基质已经历了其玻璃化转变温度(Tg)以上的温度，从而使其发生粘性流，导致表面积/体积比大大降低，并将细胞包封在低孔隙度的保护层中。

本发明的第二方面提供一种稳定化干燥组合物的制备方法，所述组合物含有悬浮于基质中的停滞态微生物细胞，所述方法包括如下步骤：

A.将微生物细胞与含有将衍生出基质的材料的水性组合物混合；

B.在能使材料发生粘性流并使基质收缩但不会过分损伤细胞的条件下对上述混合物进行干燥。

步骤B制得的组合物优选在低于基质的Tg的温度下贮存，即，该组合物的Tg高于其预期的贮存温度。

因此，优选对步骤B制得的组合物进行进一步的干燥，即所谓“二次干燥”，以提高基质的Tg，使组合物对更宽范围的贮存条件稳定化，即可在更高的温度下贮存。

本发明的稳定化干燥组合物所包含的微生物细胞优选为细菌细胞，然而并不排除使用其他微生物细胞如真菌、酵母等的可能性。如果微生物细胞是细菌细胞，则优选为革兰氏阴性细菌细胞，但并不排除可以是革兰氏阳性细菌细胞的可能性。可以提到的这类革兰氏阴性细胞的例子有荧光假单胞菌、大肠杆菌及根际细菌等。

本发明方法的步骤A中制备的混合物中，微生物细胞的浓度为10⁴-10¹³个/ml，优选10¹⁰-10¹¹个/ml。

本发明方法的步骤A中，与微生物细胞混合的材料是多羟基化合物，例如多元醇类，如甘露醇、肌醇、山梨醇、半乳糖醇，或优选为碳水化合物，更为优选的是一种糖。

如果该材料是一种糖，那么它可以是二糖、三糖、寡糖，或优选为单糖。单糖的例子可以举出己糖，如鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。二糖的例子可以举出麦芽糖、乳糖、海藻糖和蔗糖等。三糖的例子可以举出棉子糖。寡糖的例子可以举出麦芽糖糊精。

本发明方法的步骤A中的混合物中，所用的多羟基化合物的浓度为10-1000mg/10¹⁰个细胞，优选200-400mg/10¹⁰个细胞。对特定的多羟基化合物而言，技术人员利用简单的实验就能找出能制得收缩基质的多羟基化合物浓度。例如，我们发现肌醇的最佳浓度为约45mg/ml，它在60mg/ml以上引起大量细胞损伤，而在约25mg/ml以下则不收缩。