[发明专利]亲合分离方法

说明书

本发明涉及从液体中离析和分离化合物的方法。本发明为一改进的亲合分离方法，该法特别适于离析生物活性化合物。

技术的发展已使迄今为止用传统的生物化学方法来制备太复杂和太昂贵的治疗用蛋白质的工业规模生产成为可能。这种制备是通过培养生产所需蛋白质且能在控制条件下在生物反应器中生长的细胞来实现的。所使用的技术涉及通过重组DNA技术改变的微生物的发酵或培养通过杂交技术业已改变的哺乳类动物细胞。将所说细胞悬浮于含盐、糖、蛋白质和维持特定的细胞生长所必需的各种成分的液体培养基中。所需要的蛋白质可通过所说细胞分泌于所说液体培养基中或滞溜于该细胞体内。

其它感兴趣的蛋白质可用另外的办法来制备，例如通过基因改变动物的种以得到能产生所需蛋白质的动物。例如，某些蛋白质可用转基因母牛来生产，从其奶中来获取。

至少由于下述原因，业已证明从异源基因混合物中分离或纯化这些蛋白质是一件棘手的任务：在总蛋白质中所需蛋白质的百分含量常低;要被制备的液体培养基或其他液体会含大量的细胞碎片和其他粒状污染物;可能存在的热原、病原体、毒素和其他污染物的浓度高且必须除去;且必须从所说异源基因蛋白质溶液中分离出所要蛋白质而使其不变性。

由于上述原因，为了大量生产纯化的蛋白质必须使用昂贵的后处理。这些后处理包括在生产所需蛋白质后要采取的许多工艺步骤，这包括如离心分离、细胞破碎、机械筛分、微量过滤、离子交换、交叉流过滤、亲合分离、消毒、纯化和包装。在生物法生产蛋白质中，主要花费就在这些后处理工艺上。这样，提供一种通过减少工艺步骤，有效达到高产率蛋白质分离，且能在工业上使用的方法必将对生物技术的工业化成功起着促进作用。

众所周知，许多化合物与配基配合，这样这些化合物便可用已知亲合分离法的技术来离析。参见“Chromatography，Affinity”Kirk-othmer    Encyclopedia    of    Chemical    Technology，6，35-54（John    Wiley    &    Sons:New    York，1979）。此分离方法包括三相：（1）吸附相，其中所需要的化合物，例如，来自异源基因混合物的蛋白质，同化学官能团，如-配基生成-配合物，结合到不溶性基质上，所述基质，例如，聚合物或玻璃珠，（2）洗涤相，其中大部分溶液同与所说不溶基质结合不牢的污物一道被洗掉，和（3）洗脱阶段，其中洗脱液破坏所要化合物同与所说不溶基质相结合的配基间形成的配合物，从而使所需的化合物释出。可对带所说结合配基的不溶基质，即指亲合颗粒进行洗涤并重复使用，此法可重复若干次。

一般根据单位质量表面积来选择亲合颗粒。例如，虽然直径100微米的无孔珠可提供0.06m²/g表面积的珠，而直径为1微米的类似珠可提供6.0m²/g表面积的珠，直径为0.1微米的珠提供60m²/g表面积的珠。很清楚，较小的亲合颗粒可提供较大的单位重量表面积，这是更加希望的。在亲合分离时，一般希望使用表面积约大于20m²/g的亲合颗粒，这样如果希望将无孔亲合颗粒用于亲合分离工艺，这种亲合颗粒直径必须是亚微米级的。

亲合分离法用得最广是亲合色谱。亲合色谱利用紧密装填亲合颗粒的柱子，含目的化合物，例如蛋白质，的液体（例如料液流）在加压下流经此柱子。象这样的填料和固定床的动力学由Ergun方程决定。Chem.Eng.Prog，48（1952）。当所说床经历液体层流时用此方程证明穿过床的压力降同所说颗粒直径的平方成反比。如果进行计算，用亚微型亲合颗粒体系的压力降比装填直径为100微米颗粒的压力降大100万倍。因此，这种效果就不利于将这种小的亲合颗粒用于亲合分离。这样，一般的床使用粒度约为100微米的亲合颗粒来使压力降维持在可接受的范围内。

为了提供单位重量的高表面积，业已进行了种种努力来克服无孔亲合颗粒所存在的各种问题。具体讲，业已用多孔亲合颗粒来代替无孔亲合颗粒。在一般应用时，在中等压力降条件下，直径约100微米的多孔珠提供的表面积约为每珠40m²/g。