[发明专利]羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白

说明书

乙型肝炎是一种严重危害人类健康并广为流行的疾病，特别是在发展中国家。在我国，乙肝病毒携带者达1亿以上，由乙肝或乙肝有关的疾病导致死亡人数巨大，危害极大，普遍接种疫苗是控制乙肝的重要措施。

在乙型肝炎病毒(HBV)感染的某些患者血清中存在有42nm具有感染的病毒颗粒，是由病毒衣壳蛋白即表面抗原(HBsAg)，核心抗原(HBcAg)和病毒核酸(DNA)组成。另外还有不具有感染性的20-22nm的球状和棒状颗粒，仅含乙肝表面抗原。它能诱导产生特异抗乙肝病毒抗体，使人体产生免疫力。由病人血清中分离HBsAg，制成的血源疫苗，由于来源困难，成本昂贵，安全性差，不够理想。

利用基因工程技术，在不同体系中：酵母，哺乳动物细胞，重组痘苗等表达乙肝表面抗原，用作基因工程疫苗，比之血源疫苗更为安全，经济，有效，但就其免疫原性的本质与血源疫苗几乎相同，因而仍有一些不足之处：如1)5-10％的人群免疫反应低下或无免疫应答。2)所需抗原量大。3)免疫持久性4-5年。因此研究高效经济的新型乙肝疫苗十分必要。

乙肝表面抗原有三种蛋白组分：主蛋白(S)，中蛋白(M)和大蛋白(L)，这三种蛋白由HBV中同一阅读框架的DNA编码，从不同的起始码ATG起始翻译，差别在于M蛋白比S蛋白在氨端多了55个氨基酸，即前表面抗原2(preS2)区，而L蛋白比M蛋白在氨端又多了119个氨基酸，即前表面抗原1(preS1)区。M和L蛋白主要存在于病毒颗粒的外壳中。

preS1区含有不同于S的抗原决定簇。preS1区具有T细胞和B细胞水平上的免疫原性，其中氨端第21-47氨基酸的肽段，能与肝细胞膜结合(Neurath A.R.等cell 1986：46.429-436)具有诱导产生中和抗体的能力，从而能阻断乙肝病毒与肝细胞的结合，以保护机体不受感染。另外L蛋白能激活对preS1特异的T细胞，克服对S蛋白和M蛋白的不反应性。但L蛋白不易从细胞中分泌出来，并且还抑制了S蛋白的分泌(Persing，P.H.等，Science，1986，234，1388)。氨端的肉豆蔻酸化和氨端的18个氨基酸顺序都是影响分泌的原因，同时L蛋白易被降解。因此要获得含L蛋白的疫苗有一定的困难。

用合成的preS1(21-47)多肽研究证实，该区域含有HBV与肝细胞结合所必需的位点，抗preS1(21-47)单抗MA18/7和F35.25能有效地抑制HBV与肝细胞的结合，具有中和病毒的能力(Petit M.A.等，Virology 1991，180.483-491)。免疫猩猩能使其抵制HBV的攻击(Neurath A.R.等，Vaccine，1989，7，234-236)。但是，用合成多肽作为疫苗，免疫原性低，距实际应用尚有很大距离。

近来，利用乙肝表面抗原作载体蛋白，成功地将外源基因片段，如：人单纯疱疹病毒I型(HSV-I)(Valenzuela，P.等，Bio-Technology，1985，3，323.)，人免疫缺陷病毒(HIV)(Michel，M-L等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85，7957.)，脊髓灰质炎病毒(polio)(Delpeyroux，F.等，Science 1986，233，472)都插入preS2区，在酵母或哺乳动物细胞中获得表达。因此，通过将preS1免疫决定簇与HBsAg主蛋白融合的办法，获得带preS1的新型乙肝疫苗不失为一条新的技术路线。

R.E.Streeck等人曾报道，将preS1氨端氨基酸顺序1-42，在乙肝表面抗原第223位，外加5个氨基酸的接头与之融合，在SV40启动子控制下，转化细胞获得了暂时表达。虽然他们也发现在细胞内和培液中都有S和preS1的表达，能形成颗粒，但未能获得稳定的表达体系和对表达产物的免疫原性进行研究(Machein L，等，Arch.Virol，1992，4，133-136)。另外，他们使用的片段(1-42)中N端的20个氨基酸，可能会影响表达产物的分泌。