[发明专利]胶原及其制备方法

说明书

本发明涉及从动物组织中获得的纯的和非变性的胶原及其制备方法。胶原形成结缔组织并且是高级脊椎动物中的最丰富的蛋白。在天然中它以具有恒定周期性的三链螺旋的形式存在。

至少有五种典型的胶原是天然产生的。其中Ⅰ型胶原是最丰富的，它是皮肤、骨骼和腱的主要组成。

腱中存在的Ⅰ型胶原具有α₁（Ⅰ）α₂（Ⅰ）链结构，其中α₁链和α₂链两者是同系的。α₁和α₂两链通过静电力和氢桥结合，该氢桥与存在的羟脯氨酸结合，而赋予该分子特征强度和韧性。当这些键被保持在提取产物中时，它们的存在阻碍了溶液的形成，而只在极少的情况下，它可以作为在水中蛋白膨胀的结果而于酸性环境中形成凝胶。

目前，发现了胶原在医药学方面有许多应用：它可用作外科临床，烧伤治疗的治疗剂、用作载体和外科修复术的材料（缝线、纱布等），用作植入材料以及在药物及化妆品领域中用作制备软膏和油膏的原料。

因此，重要的是要尽可能地将胶原处理为非变性的、非变应性的和没有不良杂质或污染物的形式。

迄今已知的用于制备胶原的工业化方法并不令人满意，因为这些方法不能制备具有上述所要求特征的化合物。这问题与从腱中提取的胶原特别相关。实际上这种胶原是“酸不溶的”种类，并且在稀乙酸或盐酸中用常规的无机盐提取溶液技术是不易于提取的。因为这些技术要求有蛋白水解酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶）存在的情况下进行。使用这些酶不改变α₁和α₂链的多肽结构，但引起它们的展开。

此外，提取的产物通常是交联的，以便提高和改进其力学特性、降低其免疫原性和增强其抗有机的再吸收能力。

通常这种交联法是通过物理方法（光、U.V.、γ-射线、X-射线、α或β粒子、质子、电子）或者通过化学方法（甲醛、戊二醛、乙缩醛、丙酮醛、乙二醛、醌、氨基二醛、氢醌、二甲基丙酮、二甲砜）而完成。

用上述方法获得的产物是一种丧失了典型天然胶原结构的产物。

通常由腱或皮肤中进行提取时遇到的上述方法的另一个问题是为了除去在提取方法中所用的盐而需要纯化的长耗时的渗析工艺。

由于在本发明方法中没有使用蛋白水解酶或成网剂，而且比已知方法更为经济，因此本发明方法能够解决已知技术的缺点并且能够获得高纯度的非变性产物。

本发明方法可用于从牛或猪皮或者从牛腱、作为饮食和皮革工业的副产品而易于获得的原料中提取胶原。

在腱中提取的情况中，得到的“酸可溶”类的胶原是凝胶形式，该胶原可被冻干以制备在外科临床中常用的那种海绵状片。

本发明方法包括下列步骤：

（a）用稀有机酸从生物组织中提取;

（b）通过加入无机盐沉淀胶原;

（c）用稀有机酸进行可能的胶凝化;

（d）通过具有适当特性的膜切向过滤;

（e）将最终溶液或凝胶进行可能的冻干。

步骤（a）中优选地是在不高于25℃、按生物组织/酸重量比为0.1～0.01的条件下，用浓度为0.5～2M的乙酸水溶液进行。

在步骤（b）中优选的是钠盐，而在步骤（c）中，当原料为腱、生产不溶于酸的I型胶原时，则一般可使用相同的稀乙酸进行。

在步骤（d）中，首先进行等体积洗涤，然后浓缩。洗涤实际上是通过分子膜的切向过滤，该膜能够去除分子量低于膜分子分离能力的全部化合物，而不取决于它们的性质。同时，溶液或凝胶中所存在的高分子量的胶原保持在液相中并通过蠕动泵循环。

因此，通过不断地更新盐酸的操作，起始溶液或凝胶中的所存在的全部杂质可在短时间内去除。

通过切向过滤装置再循环凝胶而进行凝胶浓缩。

由于在切向过滤的每个通道都有一些液体排出，因而溶液或凝胶变得更浓。当线性压力计指出的操作反压高于40p.s.i.时，工艺可以结束。通常在这些条件下形成的凝胶的浓度在1.5～2%。在溶液情况下（由皮肤起始而获得，它提供一种可酸溶的胶原），通过测定粘度、羟脯氨酸滴定度等相应的所要求的浓度可以指出操作的结束。

附图说明：

图1和图2是上述操作的流程图。

图3是不同浓度胶原的脱盐情况。

图4是不同浓度胶原的浓度曲线图。

图1表示了在恒定体积步骤中的洗涤操作，其中1为稀乙酸储槽，2为样品，3相当于过滤膜，而4、5和6分别为蠕动泵、洗涤水出口和样品再循环。