[发明专利]一种应用于聚合酶链反应的核甙酸引物

说明书

本发明涉及一种核甙酸引物的设计，特别是一种应用于聚合酶链反应的核甙酸引物的设计及其应用。

目前，核甙酸引物用于人体心肌疾病线粒体DNA突变的研究，已有报导，如（1）、Ozawa T，Tanaka M，Sugi-yama S，et al，Multiple mtdnA deletions exist in cardiomyocytes of patients with hyperophic or dilated cardiomyopathy.Biochem Biophys Res Commun 1990;170（2）：830.（2）、Anderson S，Bankier AT，Barrel BG，et al，Sequence and organization of the human mitochondrial genomne.Nature 1981;290：457.L853引物（核甙酸序列为5′ACG AAA ATC TGT TCG CTT CA3′）与H60引物（核甙酸序列为5′AAA CAT TTT CAG TGT ATT GC3′）配合使用，利用聚合酶链反应，可对线粒体DNA第8531至第600位的8.6KbDNA片段进行扩增，但拉增效果不理想，因为有不同区段的缺失，实际扩增只有1.2Kb，有时结果难以判定。申请人发现经常缺失部位起始点在线粒体DNA第8531位至第9333位区域，需要设计新的引物进行该区域的扩增，否则就无法研究该区域内存在的基因突变。

本发明的目的是，设计一种能与L853引物配合使用，利用聚合酶链反应扩增人线粒体DNA第8531位至第9333位的DNA片段，研究该区域内存在的基因突变。

本发明的技术方案是，根据人线粒体基因组DNA序列及引物设计的基本规则，利用电脑分析候选引物的特异性，预测其各自的扩增效果，设计出H9333寡聚核甙酸引物，其核甙酸序列为5′ GGA GCG TTA TGG AGT GGA AGT G3′，并用人工将其合成，经过测定浓度，用于聚合酶链反应。

本发明H933引物为反意引物，其与L853引物合用，对应于线粒体DNA重链的9333-9311位，可以扩增出0.8Kb的DNA片段，然后应用单链构象多态性分析，可以发现该区域内存在的突变。因为该区域为突变常发区，大的缺失区起点几乎均位于该区域内，筛检出突变的机会较大。在应用其它引物（如L853-H60）检测缺失时，可以同时加入本发明H933引物，能够定量缺失线粒体DNA占总线粒体DNA的比例，以利于对不同类型的心肌疾病作出正确判断。

应用实施例。根据所测的H933引物浓度，用TE0.1（10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA，pH8.0）把引物稀释为50pmol/μl，加0.5-0.1μl至以下反应体系中，同时加入等量L853

dH20  37μl

10xPCR缓冲液  5μl

dATP dCTP dGTP dTTP  各2μmol/L

人外周血或心肌DNA模板  100mg

高纯度石蜡油  30μl

在基因扩增仪上95℃变性5分钟后，加入Taq DNA聚合酶2单位后，94℃变性，35S，50℃退火35S，72℃延伸100S，共运行45个循环，其中后20循环的72℃延伸100S后，每次循环自动增加2秒。运行完毕后取20μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果，同时还可取10μl加等体积95%甲酰胺溴酚蓝进行SSCP，银染色观察结果。

以L853和H933扩增同样模板，产生一个预测大小的片段（0.8Kb），而该片段是对尚未发生缺失的正常mtDNA扩增的结果;SSCP分析该片段，发现一例DCM病人心肌mtDNA在该片段所对应的区域内存在点突变。