[发明专利]乙型肝炎病毒基因工程e抗原在枯草杆菌中的表达

说明书

一种乙型肝炎病毒基因工程e抗原的克隆、表达。所属技术领域为生物基因工程。

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，简称HBV）是世界性传染性肝炎的病源体，流行极广。据报导，全世界有2亿乙肝病毒携带者，中国占1.1亿，仅中国乙肝患者达4千万。HBV主要通过血液传播，还能通过胎盘屏障由带毒孕妇传染给胎儿，对人们的健康危害极大。

国外从1978年，我国从1983年开始进行HBV基因工程研究，研究单位和人员遍布全世界。乙型肝炎病毒的基因组脱氧脱糖核酸（DNA）有s、c和p三个基因，HBV能产生s、c和e三种抗原。有关乙型肝炎的s基因和c基因克隆、表达的文献资料浩如烟海，表达系统有大肠杆菌，酵母和动物细胞三种，有关e抗原和c抗原的报导极少，获得e抗原的途径一部分是从患者采血，另一途径是将大肠杆菌表达的基因工程c抗原用化学处理方法转化（王光荣等，《生物化学》2，（3），1986）;邬光惠等，《生物工程学报》6（3）199-204，1990）报导，用鸟枪法克隆了e基因并在大肠杆菌中表达了e抗原。根据美国对话信息服务公司（DIALOG INFORMATION SERVICES，INC.）资料检索，截止1992年7月1日，有关HBe基因克隆表达的文献有3篇，即Loparev V.N.et  al.[Mol.Gen.Microbiol Virusol Sep（9）3-6，1991，（USSR）]报导了乙肝HBe抗原以痘苗病毒重组株在真核细胞中表达HBe基因;Inada T et  al（Virus Res Sep，14（1）27-47，1989）报导了HBe抗原在大肠杆菌中的表达;Raney A.K.et al，（Virology Jan，168（1）31-39，1989）报导了HBe抗原在人体外表层纤维细胞和EB病毒转化的B淋巴细胞中的表达及逆转录病毒介导的转移。

综上所述，已报导的工作很局限在大肠杆菌和哺乳细胞表达系统。大肠杆菌表达系统未能将HBe抗原分泌到细胞外，须破碎细胞后才能提取e抗原，由于破碎细胞后伴随有细胞碎片残存，给纯化带来困难。哺乳动物细胞培养需加小牛血清，血清中的免疫球蛋白（IgG）与表达的e抗原结合给分离提纯带来了较大困难。

诊断乙肝多采用所谓两对半试剂盒，即检测s抗原和抗体、e抗原和抗体、c抗体五项指标，检查出s抗原阳性不一定是乙肝患者，而e抗原和抗体阳性则是HBV急性感染的早期指标。因为e抗原的存在表明了HBV中DNA聚合酶的活性即HBV中的DNA的完整存在，这是乙肝具有高度传染性的标志。因此，e抗原具有重大的临床价值。由于e基因与c基因是一对重叠基因，位于c基因的+81～+450碱基对（简称bp）之间，克隆e基因十分困难。目前国内所有的e抗原基因工程产品均与c抗原有交叉反应，检测时有假阳性出现。

本发明的目的是直截克隆e基因片段，利用分泌型的枯草杆菌受体菌株表达e抗原，使e抗原分泌到细胞外，与c抗原无交叉反应，便于提取，从而得到高纯的e抗原产品。

实现本发明所采取的技术措施为：

1.表达载体的构建

枯草杆菌质粒PNQ122（南开大学蒋如璋教授赠送）缺乏强启动子，发明者以BamHI和HindⅢ消化这个质粒，去掉一个300bp片段。另外，大肠杆菌表达载体PDR540有一个由色氨酸启动子（trp）和乳糖启动子（Lac）组成的杂合强启动子tac，其下端有一个BamHI位点，在5’端的质粒部分具有HindⅢ位点。一旦消化后就可得到含有tac启动子的200bp BamHI、HindⅢ片段。由于它和PNQ122的大片段有相同粘性末端，很容易连接起来并能定向。用连接产物转化枯草杆菌Asl176原生质体，在DM₃平板上再生菌落，用卡那霉素平板筛选重组子，构建成表达载体PNQ122-tac。

2.HBVe基因的克隆

根据某些资料（Okamoto et al.，1986;Shafritz 1987），HBVe基因编码序列长369bp，产生123个氨基酸，分子量为15KD的e抗原，位于c基因的+81～+450bp之间。e基因没有自己的启动子，但有ATG，两侧正好有两个Bg1Ⅱ位点。故此，用Bg1Ⅱ消化HBV中的DNA，得到～2.8Kb和0.44Kb两个片段，电洗脱，超速离心回收，与用BamHI消化的PNQ122-tac连接，使e基因处于tac的控制之下。用上面的方法转化枯草杆菌，在卡那霉素平板上得到大量转化子。

3.HBVe基因在杜草杆菌中的表达