[发明专利]绿脓杆菌MSHA菌毛株及其建立

说明书

本发明涉及一种微生物，特别是绿脓杆菌。

本发明的绿脓杆菌MSHA菌毛株全称为铜绿假单胞杆菌（Ps.aeruginosa）甘露糖敏感血凝菌毛株，它是一种具有周菌毛性MSHA（Mannose  Sensitive  Hemagglu  tination）菌毛的绿脓杆菌，该菌毛株具有跨菌属的广谱免疫原性。

在InfectImmun  1980;40∶670报导了1975年日本学者本间逊曾发现绿脓杆菌的死菌体有免疫调节作用，其死菌注射到动物体内能激发体液及细胞免疫状态，诱导生成干拢素并具有分裂原作用，还能诱导动物抵抗接种的癌细胞的生长，但因该菌菌体毒性太大，免疫效价低，又无周菌毛性MSHA菌毛跨菌属高效广谱免疫原性特征，故无法实际应用。1980年以色列学者Gilboa-Garber教授在In  Adhesion  and  micrcorganismpathogenicity  cida  foundation  symposium  80.Pitman  Medical  p119～141.1981进一步阐明绿脓杆菌的染色体基因不能表达周菌毛性MSHA菌毛株的表型特征，原因可能是绿脓杆菌在结构上与其它革兰氏阴性菌不同，缺乏将其MSHA凝集素钩挂到细菌体表面上的基因，因而不可能出现绿脓菌活培养物的MSHA阳性株。

本发明的目的在于提供一种MSHA阳性绿脓杆菌菌毛株及其建株的方法。

绿脓杆菌MSHA菌毛株，其特征在于：

a、在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛，

b、MSHA试验呈强阳性，

c、平板菌落粘附红细胞试验强阳性，

d、酵母菌的直接凝集试验呈MS血凝。

2.绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立，其特征在于：

①降低绿脓杆菌的毒力

a、以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株为样本，

b、用普通培养基和药液组成的混合培养基中在37～41℃培育5～20天经200次以上传代，

②周身性MSHA菌毛的表达

a、提取细胞染色质DNA：采用反复冻化及SDS综合法协同进行破坏菌体，然后脱去蛋白质，

b、获得DNA小片段：取上述减毒菌株的染色体DNA采用PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合内切酶在65℃酶切1～2小时，

c、使DNA小片段重新随机接合：取含有DNA小片段的液体加入0.3%～0.5%连接酶，在0～12℃作用1～12天，

d、DNA解双链并除菌：向上述重新接合有长链DNA的液体中加入PstⅠ、EcoRⅠ和HPaⅡ复合解链酶在65℃酶切约5分钟，然后采用常规方式灭菌，

e、将单链的DNA与减毒菌体结合：将上述解去双链的DNA液加入到含有CaCl₂的减毒菌株内在加有2%琼脂的普通培养基中于37～41℃共同培育。

本发明主要是对绿脓杆菌进行连续传代使之毒力降低，再应用基因工程法实现周身性MSHA菌毛的表达。

本发明绿脓杆菌MSHA菌毛株的建立

一、降低绿脓杆菌的毒力

本发明是以自然界的非周菌毛性、非MSHA性强毒绿脓杆菌强毒株（LD₃₀＝10⁷个活菌）为样本，在普通培养基中如采用由0.3%肉膏、牛肉浸液、1%的蛋白胨和0.5%的氯化钠构成的培养基（PH＝7.4～7.6）经高压灭菌后的产物中再加入药液。该药液可以是西药中的抗菌素药物如庆大霉素、多粘菌素等，也可以是中药里的清热解毒药物如海蚌含珠、紫花地丁、丹皮、鬼针草、苦菜及黄芪等。将上述药液加到普通培养基中使之浓度低于抑菌浓度。这些药物的杀菌浓度各不相同，取其杀菌浓度的十分之一作为抑菌浓度，使之产生抗药性以减低毒力。在37～41℃的温度条件下培育5～20天传代一次，多次重复上述操作经过200代后其毒力减低到可供制备菌苗之用。其毒性虽较原始菌样本株的毒力下降了，但仍保持原有完整免疫原性，即注射小白鼠非致死量后仍然能形成足够的特异性抗体和细胞免疫。

二、周身性MSHA菌毛的表达