[发明专利]具有改善稳定性的异水蛭素的制备方法

说明书

本发明涉及新的异水蛭素及其制备方法，由于在Asp-Gly基链区段的交换作用，因此所合成的异水蛭素具有改善的稳定性。这一方面使生产时产率增加，另一方面可以制备待用的可直接注射的溶液剂药物制剂。

已知可由水蛭中得到具有医疗价值的对凝血酶有高亲和力的抑制剂，它可用作人的治疗药，人们期望血栓形成的治疗有重大的进展。这些肽类抑制剂称作水蛭素，并且已知有许多种天然的异水蛭素，它们只是在序列中有几个氨基酸不同。天然异水蛭素例如在EP-A142860，EP-A158564，E-A158986，EP-A168342，EP-A171024，EP-A193175，EP-A200655，EP-A-209061，EP-A-227938中已有叙述。过去十年中DNA重组技术的进展有可能使用经遗传操作加以修饰的微生物以工业规模制备水蛭素。例如在EP-A171024和EP-A200655有其引用的文献中叙述了根据天然序列制备异水蛭素的方法。

然而，现今一个药物要满足的条件远远超过治疗活性。这些条件包括制造的费用，临床应用的方便和长期使用时有较高的稳定性。

为了使改进的治疗能够有利于广大患者，其中包括经济费用，必须使该药物制造的费用较低。对于遗传工程产物，可通过开发优化的表达系统来实现，但也要使药物适合于该表达系统。异水蛭素在这方面的结构优化，叙述于例如EP-A324712和EP-A448093。

长期使用的药物应考虑其有较高的稳定性，以避免生成的分解产物引起治疗学和药理上的并发症。由水蛭中已知的异水蛭素和从经遗传操作修饰的微生物得到的脱硫水蛭素，在这方面是令人不满意的，由于它们在结构上内部发生化学变化，易于生成副产物。从制造过程的经济观点看，预先能杜绝副产物的生成是有利的，因为无需将其除去。这就会使产率提高。

改善稳定性还可以使制剂能够贮存并可将用药费用降到最低程度。在水蛭素的情况下，稳定的、可直接注射的随时可用的溶液剂还应当有长期可利用性这一特点。在这一点上，已知的异水蛭素的化学不稳定性事实上是个限制因素，因为溶解后的物质受温度影响形成副产物，即使贮存在冰箱中，这种制剂也只能在有限的(短)期间应用，所以很难达到经济的目的。

已知的天然异水蛭素和在药物开发中由它得到的脱硫水蛭素，只是在几个氨基酸单元上有区别，因此可以把氨基酸序列中的易变区段和保守区段区分开。保守区段包括的序列是-Ser³²-Asp(Asn)³³-Gly³⁴-和-Asn⁵²-Asp(Asn)⁵³-Gly⁵⁴-Asp⁵⁵-。该编号是Dodt等在FEBS LETTERS 165(1984)180-183中发表的含65个氨基酸的序列。水蛭素分解产物的蛋白质化学分析现已表明，这些序列的基链主要支配着水蛭素的化学不稳定性。在这个意义上不需要考虑天冬酰胺脱酰胺生成天冬氨酸的作用，因为这生成另一种天然的异水蛭素。水蛭素分解的实质是在两个-Asp-Gly顺序上的异构化和消旋化作用。由文献中已知蛋白质分解时这些反应的重要性(JBC262，1987，785-793页和JBC264，1989，6164-6170页))。同样水蛭素的羧基端结构对于它与凝血酶的高亲和力结合的重要意义也是已知的。在序列中具有保守性质并且参与结合的区段处的氨基酸交换，会有丧失亲和力的危险。现在令人惊奇地发现，可以在保守区段进行一些改善稳定性的修饰，而不减弱对凝血酶的亲和力，因而不会减低活性(实施例7，表1和实施例8，表2)。

另外，还有令人惊奇的情况，即尽管进行了氨基酸的交换，甚至不止一个，仍不会增加抗原性。

此外，还发现两个-Asp-Gly-序列对水蛭素的不稳定性产生相同的影响。只要改变这两个序列区段，就可显著地减低副产物的生成(实施例9，表2)。

在酸性条件(实施例11，图3)和生理pH条件(实施例10，图4)下，母体化合物和优化的脱硫水蛭素形成副产物的时间过程表明，氨基末端对稳定性无影响，因而对它的改变无助于稳定化作用。从上述情况可以看出，实例〔Vla¹，Thr²〕脱硫水蛭素所显示的优化作用可适用于具有不同的氨基末端的异水蛭素(例如〔Val¹，Aal²〕-和〔Ile¹，Thr²〕-脱硫水蛭素。