[发明专利]从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺

说明书

纤维结合蛋白（Fibronectin，Fn），又名纤维连接蛋白，纤粘素等。文献中也使用以下名称：CIG，anti-gelatin  factor，microfibrillar  protein，opsonic  protein，fibroblast  surface  antigen（FSA），soluble  fibroblast  antigen（SF-antigen），galactoprotein  a，cell  surface  protein（CSP），cell  attachment  factor  （CAF），cell  spreading  factor，large  external  transformation-sensisive（LEFS）protein，Zeta（Z）等。

纤维结合蛋白是一种高分子量冷凝蛋白，分子量约45K，存在于人及动物的体液（血液、羊水、组织液）及细胞表面及间质中，具有诱导细胞分化、增殖、连接细胞和间质、参与血液凝固、伤口愈合和机体防御等多种功能，是机体的重要组分。

对近20年（1972～1992）国际国内专利文献及科学文献的查新表明，以往已有一些提取纤维结合蛋白的方法（Ruoslahti  E等Methods  in  Enzymol  1982;82：803及Isumera  M等  J  Biochem  1981;90：1），国外已有二个专利（Ep38462-A，1986;WO63483，1988）。国内尚无与本发明类似的专利申请。

现有的提取纤维结合蛋白的方法在提取中，使用多种大量的蛋白酶抑制剂，同时，采用三步或三步以上的层析步骤，使所用试剂药品增加，成本上升，而且提取手续繁杂，纤维结合蛋白的产生率不高。现有的提取方法局限于血液，原料来源受到限制。

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明不仅降低了成本，简化了提取步骤，增加了产品的产出率，而且提高了产品的纯度。本发明可广泛应用于人及多种动物的多种体液（包括血液、羊水和组织液），开拓了更广泛更廉价的原料来源。

为了实现上述发明目的，本发明者采取的生产工艺是：（1）获取体液;（2）加入苯甲磺酰氟，低温超速离心;（3）加样于预制好的溴化氰琼脂糖凝胶白明胶层析柱，缓冲液洗脱纤维结合蛋白;（4）提取的纤维结合蛋白过滤、测量、无菌冻干;（5）提取的纤维结合蛋白生物学功能检测。本发明者注意到，纤维结合蛋白在进化过程中表现出很强的稳定性，人及各种动物体液中纤维结合蛋白的结构近似，主要的生物学功能相同。这为本发明的纤维结合蛋白的获取提供了广泛的价廉的原料。本发明根据纤维结合蛋白的分子量、冷凝性质。以及纤维结合蛋白与纤维蛋白、白明胶、原胶元有强烈亲和能力的理化特性，设计了本发明的生产工艺。

首先采集人和多种动物，如牛或马或猪或其他动物的体液，如血液或羊水或组织液，立即加入1/10的3～10%的枸椽钠抗凝（血液），同时用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟（市售）抑制蛋白酶活性，保持在0～4℃低温下，并低温超速离心，0±1℃，7，500～25，000  RPM，10～40分钟，取上清液。

上清液加样于缓冲液A（主要含0.5～1mol/L Ttris-HCL，0.1～0.2mol/L PMSF，0.5～5%NaCl（溶液）平衡的白明胶琼脂糖凝胶层析柱上，琼脂糖凝胶和白明胶为市售产品。层析柱预先以溴化氰活化，活化液中主要含四硼酸钠0.1～0.2mol/L，偶联缓冲液主要含乙醇胺0.5～2mol/L，叠氮钠0.1～1mol/L，以上试剂均为市售产品。以ZY-1型紫外分光光度计（280nm）监测，以含脲缓冲液B洗，含脲缓冲液B主要含Tris-HCl 0.5～1mol/L，PMSF 0.1～0.2mol/L，脲3-8mol/L。在两小时中，50ml容积的琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱可以加入350～500ml样品。再用含高浓度Na⁺的缓冲液B洗下纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0～5℃进行。提取的纤维结合蛋白可达电泳纯，储存于3～8mol/L的脲缓冲液B中。纤维结合蛋白经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用分光光度计测定，280nm处吸收，计算纤维结合蛋白产量，分装，无菌冷冻干燥。