[发明专利]尖吻蝮蛇毒去纤酶纯化方法

说明书

本发明属于一种制备药物的方法，尤其涉及一种用离子交换柱层析分离纯化得到高生物活性物质-尖吻蝮蛇毒去纤维蛋白原酶（简称去纤酶）的方法。

现有技术中如台湾Ouyang，C.等（Thromb.Diath  Haemorrth，26∶224  1971）将尖吻蝮蛇毒经DEAE-Sephadex  A-50柱层析分离，得12个蛋白峰，峰10具有凝血酶样酶（简称TLE）活力，并将其再经Sephadex  G-200两次纯化得单一的TLE，分子量为33500。Ouyang先用800ml、0.005M、PH8.0醋酸铵缓冲液洗脱，然后再用1000ml、0.25M、PH6.0与1000ml、1.0M、PH5.4醋酸铵缓冲液进行盐浓度及PH梯度洗脱，可分离为12个蛋白峰，峰10为含TLE组分。然后将峰10经Sephadex  G-200再分离，用蒸馏水洗脱，再重复一次得纯化的TLE。按这一方法，其TLE得率低，约为0.5%。同时该操作均须在5℃下进行，即在低温下操作。该法的主要缺点是PH值太低即5.4-6.0，TLE在该PH值下活性较低，甚至大部份活性丧失。因此，只峰10显示TLE活性，而且由于缓冲液PH值接近TLE的等电点，既难于分离也易于沉淀，因而绝大部分TLE未分离得到或是未显示出其酶活力而被遗弃。再一个缺点就是必须在低温（5℃）下操作，这不仅增加设备及成本也给生产人员带来不便。另外该法只在实验室应用，还未用于生产。

国外虽有由红口蝮、矛头蝮和东部菱斑响尾蛇毒生产TLE的，但其TLE的产率低，且我国无这三种蛇，即缺泛药源，同时上述产品Ancrod、Defibrase、Crotalus对血管闭塞性疾病的疗效仅为70%，而自发性出血约为5%。要解决上问题，首先寻找新的含TLE量高的新药源。蛇毒TLE主要来自蝮亚科蛇毒。我国蝮亚科毒蛇较多的有蝮蛇、尖吻蝮、竹叶青、烙铁头等。尖吻蝮（Agkistrodon  acutus）蛇（五步蛇、百步蛇）主产于我国，分布于长江及以南各省，据不完全的统计，目前我国每年可取尖吻蝮蛇毒冻干品4000克以上，而且只是捕捉的部分，实际藏量相当丰富。目前我国有尖吻蝮蛇毒现存量10kg以上。经检测，尖吻蝮蛇毒中的TLE含量是较高的，约占全毒的20%，蝮蛇毒产量较多，但TLE含量较低，而且含有神经毒素不易除去;竹叶青蛇毒TLE含量较高，但产量太少，每年不上100克;因而尖吻蝮蛇毒是较为理想的TLE药源。尖吻蝮蛇毒与蝮蛇毒一样，其出血毒素含量也较高，因而要得到药用的TLE，其生产技术（工艺）即成为至关重要的问题。

本发明的任务是利用新的药源并提供一种产率高，其产品疗效高，副作用少的尖吻蝮蛇毒去纤酶的纯化方法。

本发明所说的蛇毒去纤酶的纯化方法，它包括：（1）蛇毒用缓冲液溶解，离心沉淀经阴离子交换剂柱层析，用缓冲液洗脱粗分得凝血酶样酶组分;（2）将所得凝血酶样酶组分又分别经阴离子交换剂柱层析，纯化得精制的凝血酶样酶;（3）将精制凝血酶样酶原液再经脱盐得去纤酶原液;（4）将所得去纤酶原液配方，过滤、分装、冷冻、干燥、熔封、即得注射用去纤酶成品;其特征在于：

a、蛇毒用PH7.8-8.6的缓冲液溶解，经阴离子交换剂柱层析，用PH7.8-8.6缓冲液氯化钠直线梯度洗脱粗分得凝血酶样酶组分;

b、将所得凝血酶样酶组分按顺序或分两组经阴离子交换剂两次以上柱层析，用PH7.8-8.6缓冲液氯化钠直线梯度两次以上洗脱纯化得精制凝血酶样酶原液;

c、粗分所得凝血酶样酶组分及再纯化中所得凝血酶样酶原液不经冷冻干燥或浓缩可直接上样，全工序操作在10°～20℃以下半无菌或无菌室中进行。

溶解蛇毒所用的缓冲液是0.05～0.10M  Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，粗分所用阴离子交换剂是DEAE-Sephadex、A-50或QAE-Sephadex、A-25， 粗分所用氯化钠梯度为0～1.2M，纯化方法，其特征在于纯化两次柱层析所用阴离子交换剂是DEAE-纤维素DE52或DE32和DEAE-SephadexA-50或QAE-Sephadex、A-25，纯化两次洗脱所用氯化钠梯度为0.1～0.7M，0.3～0.9M。本发明的优点为：

1、本法得率为所有蛇毒TLE生产方法中得率最高，为15～20%是国外的6～8倍，为Ouyang·C的30～40倍。粗毒中的TLE70～100%被分离得到，结果表明该法先进可行。