[发明专利]生产蛋白酶的方法

说明书

本发明涉及一种新的蛋白酶，这种蛋白酶特异性地切割多肽的氨基酸序列上谷氨酸残基的羧基端的肽键，还涉及从芽孢杆菌属细菌中生产蛋白酶的方法，编码该蛋白酶的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，将该表达载体引入宿主中而获得的转化体，以及利用该转化体生产该蛋白酶的方法。

已知来源于金黄色葡萄球菌V8的株的V8蛋白酶是一种作用于蛋白质(即：多肽)并且能特异性地切割谷氨酸(Glu)残基羧基端的肽键的酶(Gabriel R.Drapeau et al.，J.Biol.Chem.247，20，6720-6726，1972)。将这种酶分类为丝氨酸蛋白酶。C.Carmona等人已克隆了编码这种酶的DNA序列(Nucl.AcidsRes.，15，6757，1987)

还已知一种类似的酶，一种对酸性氨基酸残基有特异性并且来源于放线菌灰色链霉菌的肽链内切酶(Norio Yoshida et al.，J.Biochem.104，3，451-456，1988)。其次，还有一种来源于枯草芽孢杆菌，特异性地作用于谷氨酸残基的蛋白内切酶也是已知的(Takuro Niidome，Norio Yoshida，Fusahiro Ogata，Akio Ito，and Kosaku Noda，J.Biochem.108，965-970，1990)；日本生物化学学会第62届全体会议摘要)。

前面所说的酶适用于为了进行蛋白质结构分析等而需要在前面所说的位点处对蛋白质进行特异性切割，或者当使用重组DNA技术生产特定融合蛋白形式的所需蛋白，其中通过切割获得所需蛋白时使用前面所述酶。在后一种情况，例如，当已产生的所需蛋白是一种融合蛋白形式，该融合蛋白中，所需蛋白通过一个谷氨酸残基与另一种蛋白质连接时，可利用这样一种酶切割而将所需蛋白分离。为此，除了上述的酶之外，非常希望能获得具有这种类型酶活性的其他蛋白酶。

本发明的新型蛋白酶克服了上面讨论的以及现有技术中的许多其他的缺陷和不足之处，这种酶来源于地衣形芽孢杆菌，该蛋白酶切割多肽的谷氨酸残基的羧基端的肽键。

在一个优选的实施例中，该蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌ATCC NO.14580。

在一个优选的实施例中，该蛋白酶有下列性质：

(1)最适pH：约8.0和

(2)稳定的pH范围：pH6.5～8.5，于25℃。

在一个优选的实施例中，该蛋白酶含有从SEQ ID NO：1中的+1位丝氨酶到+222位上的谷氨酰胺之间的氨基酸序列。

在一个优选的实施例中，该蛋白酶含有从SEQ ID NO：1中的+1位丝氨酸到+222位谷氨酰胺之间的氨基酸序列，并且切割多肽的谷氨酸残基的羧基端的肽键。

本发明的DNA序列编码上文所述的蛋白酶。

在一个优选的实施例中，该DNA序列含有从SEQ IDNO：1的605位胸腺嘧啶残基到1270位的腺苷残基之间的碱基序列。    

在一个优选的实施例中，该DNA序列编码一种蛋白酶，该蛋白酶含有从SEQ ID NO：1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到+222位上的谷氨酰胺之间的氨基酸序列。

在一个优选的实施例中，该DNA序列含有从SEQ ID NO：1的223位胸腺嘧啶残基到1270位的腺苷残基之间的碱基序列。

本发明的表达载体含有上文所述的DNA序列。

在一个优选的实施例中，该表达载体可在芽孢杆菌属细菌中表达。

本发明的转化体可通过将上述表达载体引入宿主中而得到。

在一个优选的实施例中，该宿主是芽孢杆菌属菌株。

制备本发明的蛋白酶的方法，包括在培养基中培养能生产上文所述蛋白酶的地衣形芽孢杆菌菌株以及从培养基中回收产生的蛋白酶。

制备本发明的蛋白酶的方法，包括在培养基中培养上文所述的转化体以及从培养基中回收产生的蛋白酶。

应说明白，在不超出本发明范围和精神的情况下，本领域内熟练技术人员可以容易地进行各种对他们来说是显而易见的修改。因此，本发明所附带的权利要求书的范围并不是为了限制说明书描述的内容，该权利要求书是用来包括所有存在于本发明中的可以被授予专利权的新颖性特征，包括所有那些与本发明相关的被本领域中熟练技术人员认为是其等同特征的内容。

因此，本文描述的发明是为了实现下面的目的：

(1)提供一种具有能够在谷氨酸残基的羧基端对多肽进行特异性切割的酶活性的新型蛋白酶；和