[发明专利]提取蟾蜍灵的方法及其蟾蜍灵和有关衍生物的用途

说明书

本发明是将蟾蜍灵、华蟾蜍精、蟾蜍它灵以及与蟾蜍二烯内酯有关的化合物、衍生物作为医药，具体指治疗白血病、皮肤癌等肿瘤的治疗医药的有效成分。

蟾蜍二希内酯是用有机溶煤乙醇或氯仿从中药蟾蜍提取物中的一类甾族化合物，其中主要包括蟾蜍灵、华蟾蜍精、蟾蜍它灵、惹斯蟾蜍甙元等化合物。这些化合物在结构上的特点为：在甾体结构的骨架上有一个α-不饱和-γ吡喃酮基。在基础研究上这些化合物具有强心和局部麻醉作用为所周知。但目前为止没有见到有关这些化合物作为临床治疗药或是治疗白血病和其它肿瘤方面的报道。

近年来，世界上在对促使肿瘤细胞向正常细胞转化（分化）的诱导分化活性化合物的研究方面进行了大量的工作，也发现了一些能使肿瘤细胞向正常细胞转化（分化）的化合物，但是对不同的肿瘤细胞都具有诱导分化作用（活性）的化合物非常少。因此，本发明者以发现能对不同的肿瘤细胞和不同的白血病细胞都具有诱导分化功效的新化合物，并能使这些新化合物成为抗肿瘤药作为目的进行了研究。

本发明者的研究构思和方法是：首先从蟾蜍（中华大蟾蜍的耳后跟及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥而成）中先用氯仿提取后氯仿提物再用丙酮∶环己烷（1∶5;1∶3V/V）作为洗脱剂，经硅胶柱层析分离和提纯，得到结构式中的蟾蜍灵（Ⅰ）和下面图中所示的华蟾蜍精（Ⅳ）、蟾蜍它灵（Ⅴ）、惹斯蟾蜍甙元（Ⅵ）和去乙酰基华蟾蜍精（Ⅶ）：

这些化合物被发现都对不同的白血病细胞有诱导分化效果，其中蟾蜍灵和华蟾蜍精对四种不同的人的白血病细胞有诱导分化作用。另外发现这些化合物对白血病以外的人的肿瘤细胞也有很强的细胞诱导分化或细胞毒性作用。其中以蟾蜍灵为最强，因为蟾蜍灵和有关的化合物对四种不同的骨髓性白血病细胞都具有诱导分化能力（脱癌作用），因此可以发展成为或作为抗肿瘤医药被使用。本发明的结构式（Ⅰ）中所示的蟾蜍灵，可以按常规的方法，制成口服剂，或者是注射的形式而被服用，最好作为口服剂，也可作为丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等药剂。另外，蟾蜍灵和已知的诱导分化胶，全反式维生素A酸（All-trans-Retinoic acid），1α-25二羟基维生素D₃（1α、25-dilydroxyvitaminD₃），肿瘤坏死因子（γ-TNFα）和干扰素（Interferon-γ）等同时服用时，有强的协同增效作用的功效。因此能提高对白血病和其他肿瘤的治疗效果和减轻单剂量药物服用时的毒副作用。

下面对本发明的化合物蟾蜍灵和有关蟾蜍二烯内脂类的化合物的药理作用通过具体的实验例子加以说明。

实验例1：

把本发明化合物对人骨髓性红白血病细胞K562的细胞毒性（活细胞数比全体细胞数）即活细胞率（viability））和对NBT（Nitro Blue-tetrozolium）的还原能力作为制定本发明化合物对癌细胞的分化诱导活性的指标，测定方法按K.Tanaka等人（Cancer Res.，42，5152（1982））所记载的方法来进行的。用本发明物和K562细胞（1×10⁵cells/ml）一道培养4天。培养条件为，以RPMI1640+10%FCS（牛胎儿血清）（56℃，30分钟加热失活处理）作为培养液，在5%二氧化碳和95%的空气培养器中进行。细胞培养液中加入用二醇（99%），完全溶解的本发明物，使培养液中加入的乙醇浓度的含量不超过0.1%。（乙醇在此浓度下对细胞无任何影响，别外，用生化学的方法和用May-Gruanwald-Giemsa液，对诱导分化后的细胞进行染色，进行细胞形态学上的检查，发现被分化的细胞在形态学上是向Macrophage和成熟的单核细胞分化（正常细胞转化）其实验结果被简略地表示在表1。