[发明专利]一种利用基因重组技术制造丙酰螺旋霉素的方法

权利要求书

1.一种利用基因工程技术制造丙酰螺旋霉素的方法，其特征包括如下步骤：

A.建立麦迪霉素产生菌(Streptomyces mycarofaciens 1748)的基因文库，

B.用碳霉素产生菌4＂-异戊酰转移酶基因为探针，从麦迪霉素产生菌基因文库中获得麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因(BamHI-BamHI8.0kb片段)，

C.将BamHI-BamHI8.0kb片段与pIJ680载体相连，构建含麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的重组质粒(p6F5)，

D.将重组质粒p6F5转入螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus 371)，获得含麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株(Streptomyces spiramyceticus(p6F5)MA-S371：371(p6F5)CGMCC No.0161)，

E.将Streptomyces spiramyceticus(p6F5)MA-S371：371(p6F5)CGMCC No.0161在硫链丝菌素黄豆饼粉-淀粉培养基上培养，经种子及发酵培养，从发酵液提取，分离，纯化，得丙酰螺旋霉素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于是以粘粒质粒pNJ1为载体建立麦迪霉素产生菌(Streptomyces mycarofaciens 1748)的基因文库。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于以碳霉素产生菌4＂-异戊酰转移酶基因为探针，与麦迪霉素产生菌(Streptomyces mycarofaciens 1748)基因文库进行菌落杂交，得到阳性菌落pCN10F5，再与pCN10F5 DNA进行分子杂交，获得与探针同源的BamHI-BamHI8.0kb片段，该片段含有麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于将含有麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的BamHI-BamHI 8.0kb片段，与质粒载体pIJ680相连，构建含有麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的重组质粒(p6F5)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于将重组质粒(p6F5)在15-50％浓度PEG的媒介下，转入螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus 371)的原生质体中，获得含有麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株(Streptomyces spiramyceticus(p6F5)MA-S371：371(p6F5)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于将含有麦迪霉素4＂-酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株，在含有5-30ug/ml硫链菌素的黄豆饼粉-淀粉培养基上，于25-35℃培养5-14天，用挖块法接种于种子培养基(葡萄糖0.5-2％，淀粉2-4％，黄豆饼粉1-3％，NaCl 0.4％，CaCO30.3-0.8％)，28℃培养0-80小时，以2.5-10％接种量种入发酵培养基(葡萄糖1-3％淀粉2-6％，鱼粉1-3％，玉米浆0.5-1.5％，NH4NO3 0.6％，KH2PO40.01％-0.08％，MgSO40.1％，NaCl 1.0％，CaCO30.3-0.6％)26-30℃培养72-120小时，发酵液用溶媒法如乙酸乙酯进行提取和精制。