[发明专利]纯尿激酶酶原与人血清白蛋白通过二硫桥键共价连接形成的血纤维蛋白溶酶原激活剂复合物

说明书

本发明涉及使用尿激酶酶原作为溶解血栓的药剂，以溶解患者体内的血纤维旦白凝块。

尿激酶酶原（UK酶原）由单链组成，分子量为55千道尔顿，是双链尿激酶（UK）的前体（酶原）。在美国再颁专利32，221中Husain等人对尿激酶酶原作了详细描述，在本文中作为参考。单链尿激酶酶原经酶促转化作用活化为双链UK形式，其特征是转移丝氨酸旦白酶家族到适当位置。尿激酶酶原通过静脉注射后很快从血浆中清除，约为5-8分钟。这一清除时间比它的活性衍生物即高分子量的双链UK的清除时间短。

本发明描述了由纯尿激酶酶原与人血清白蛋白（HSA）共价连接形成的血纤维旦白溶酶原激活剂复合物。形成的复合物可明显延迟尿激酶酶原从血浆中清除，同时保留了溶解血纤维旦白的特性。本文所说的“尿激酶酶原”是指天然存在的或重组产生的UK酶原（UK酶原的任何酶原缺失突变型）、或者是任何具生物学活性的UK酶原的单链衍生物或片段，该衍生物或片段含有一个能与HSA的游离半胱氨酸残基进行硫醇一二硫基转换的胱氨酸残基，在下文将详细描述。本文所说的“HSA”是指天然存在的或重组的HSA。本文所说的“纯”是指在使用前该复合物实质上（占重量的95%或更大）不含其它物质（如血液或组织培养物中的其他成分）。

由于本发明所述的复合物比UK酶原本身在体内具有更长的半衰期，因而提高了它在血栓溶解治疗中的使用价值。而本发明的复合物不仅可预防血栓形成，而且能长期地预防心血管病变，如已知与血纤维旦白溶解活性受抑制有关的动脉粥样硬化。

由于在体内的半衰期得到改善，本发明所述的UK酶原：HSA复合物可通过静脉内注射方法用于治疗。从而改进了UK酶原本身在治疗中使用，因为UK酶原在体内的半衰期短，在治疗时必须进行连续静脉内注射，从而给治疗带来极大的不便，尤其是医院外的治疗。

本发明的其它特征和优点在下面描述的优选实施例和权利要求中能明显地看出。

首先对附图进行描述如下：

图1（a）是完整的单链UK酶原分子的模式图，（Holmes  et  al，Biotechnology（1985），3，923-929）;图1（b）显示单链UK酶原与HSA的共价连接。

图2显示UK酶原/HSA混合物在37℃中温育4小时后过滤层析结果。收集0.5ml馏出物测定蛋白质含量（O）和血纤维旦白溶解活性（O）。

图3是UK酶原在不同介质中温育后的酶谱。

泳道2-在缓冲液中温育

3-在HSA中温育

4-在CBS血浆中温育

5-在CBS血浆和HSA中温育

6-在血浆中温育。

7-10：表示经过α（HSA）-Sephadex柱后UK酶原与HSA一起温育。

图4显示

泳道2-3表示纯化的复合物的酶谱。

4-表示纯化的复合物与α（HSA）温育1小时后的酶谱，

以及通过α（HSA）-Sephadex柱后纯化的复合物的酶谱。泳道3中的样品在电泳前先在SDS缓冲液中煮沸2分钟，而不用在37℃  SDS缓冲液中温育30分钟这一经典方法。

图5中泳道2，3，4分别表示pH值为5，7.5，9时UK酶原与纯化的HSA中温育后的酶谱。泳道6，7，8分别是在Zn²⁺、Ca²⁺、以及Zn²⁺和Ca²⁺存在时UK酶原与纯化的HSA温育后的酶谱。泳道9是UK酶原与HSA浓度比为10时两者一起温育后的酶谱。

图6中显示

泳道2-UK酶原在缓冲液中温育后的酶谱

泳道3、4、5和6分别表示UK酶原在血浆中温育0小时、1小时、2小时、6小时、的酶谱。

7-表示UK在缓冲液中温育后的酶谱。

8、9-分别表示在血浆中温育0，6小时后的酶谱。

10-表示在浓缩尿中温育后酶谱。

图7是HSA经DFP和氯胺T处理（不影响形成复合物）以及BSA经DTT处理（使之恢复与UK酶原形成复合物的能力）后得的酶谱。

泳道1-UK酶原在缓冲液中温育。

2-UK酶原与HSA一起温育。

3-UK酶原与缓冲液处理的HSA一起温育

4-UK酶原与DFP处理的HSA一起温育

5-UK酶原与缓冲液处理的HSA一起温育。

6-UK酶原与氯胺T处理的HSA一起温育。

7-UK酶原以二聚体形式存在于缓冲液。

8-相同二聚体形式的UK酶原与BSA一起温育。