[发明专利]二对检测人巨细胞病毒DNA的引物的制备方法

说明书

本发明涉及一种用DNA合成仪制备二对能检测人巨细胞病毒DNA的引物的方法，属生物化学试剂制备的技术领域。

人巨细胞病毒在人群中感染极广。约1%的新生儿受其感染，这是造成新生儿死亡、畸形、弱智和非遗传性神经性耳聋的一个重要原因。人巨细胞病毒感染也是爱滋病病人死亡的直接原因。已有的检测人巨细胞病毒感染的方法是在被测样品中加入一对检测人巨细胞病毒DNA的引物，通过多聚酶链反应，进行体外DNA扩增，从而便捷而准确地检测出人巨细胞病毒感染情况。Demmler  G  J.等人在题为°利用多聚酶链反应和体外DNA扩增检测新生儿尿液中的人巨细胞病毒（Detection  of  cytomegalovirus  in  urine  from  newborns  by  using  polymerase  chain  reaction  DNA  amplification）'一文（载于J.Infect  Dis.1988，158（6），1177-84）中提及一种用DNA合成仪制备的一对正在申请专利的、可用于检测人巨细胞病毒DNA的引物，但该引物的多聚酶链反应体外DNA扩增过程耗时较长，需6.5小时。

本发明的目的是提供一种用DNA合成仪制备二对能快速检测人巨细胞病毒DNA的引物的方法。

图1是美国Applied  Biosystems公司出品的381A型DNA合成仪的外形示意图，其中1～9是试剂并，10是主程序按钮，11是电源插头，12是电源开关，13是控制面板，14是键盘，15是显示屏，16是机壳，17是散热孔，18是反应柱，19是引物收集管。

制备DNA的引物时，一般总采用DNA合成仪。用本发明制备二对能快速检测人巨细胞病毒DNA的引物，DNA合成仪为美国Applied  Biosystems公司出品的381A型DNA合成仪。制备步骤可说明如下：

第1步，设计引物顺序。从由上万乃至数十万个核苷酸残基组成的人巨细胞病毒DNA中，找到最为合适的核苷酸残基排列顺序片断;根据核苷酸残基配对原则，写出与上述片断互补的核苷酸残基排列顺序作为引物中核苷酸残基的排列顺序，即引物顺序。执行本步骤时，无简便方法可循，只能靠知识、经验和实验。实验指利用DNA合成仪找到的大量引物顺序和下述6个步骤合成大量引物，再从能否检测人巨细胞病毒感染和多聚酶链反应体外DNA扩增过程耗时长短二个方面对新合成的引物进行筛选。工作量极大。本发明人共筛选出二对引物的4条引物顺序，它们是

其中，A、G、C和T分别表示脱氧腺嘌呤核苷酸残基、脱氧鸟嘌呤核苷酸残基、脱氧胞嘧啶核苷酸残基和脱氧胸腺嘧啶核苷酸残基。

第2步，接通电源。把381A型DNA合成仪的电源插头11插入交流市电插孔，该仪内的微机因得到供电而工作。

第3步，装注原料。把作为原料的试剂脱氧腺苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧鸟苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胞苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胸苷二异丙基亚磷酰胺、TCA（三氯醋酸）、I₂（碘）、四唑、DMAP（二甲基氨基吡啶）、乙酸酐和乙腈分别注入，并注满试剂并1～9。试剂并1～9的容量为25毫升。上列9种试剂均为美国Applied Biosystems公司的产品。

第4步，键入引物顺序。利用351A型DNA合成仪控制面板13上的主程序按钮10和键盘14，键入所需制备引物内的核苷酸残基排列顺序。键入的引物顺序示于显示屏15。制备引物IEA-01时，键入的引物顺序为5'-TTTAGCACGGGCCTTAGCCT-3'。制备另3种引物时，键入的引物顺序可依次类推。

第5步，键入反应时间。利用351A型DNA合成仪控制面板13上的主程序按钮10和键盘14，键入所需制备引物的反应时间。键入反应时间（分）示于显示屏15。制备1微摩尔数（umol）的引物IEA-01、引物IEA-02、引物LA-01和引物LA-02时，键入反应时间应分别为228、228、312和324分，即3.8、3.8、5.2和5.4小时。

第6步，接通工作电源。按一下电源开关12，381A型DNA合成仪的引物合成部分得到供电，在微机的控制下，使原料在反应柱18中自动合成所需引物。引物合成部分工作时会发热，热量通过位于机壳16两侧的散热孔17散出。

第7步，收集成品。在反应柱18中合成的所需引物（成品）经橡皮管引出，滴入专用收集成品的引物收集管19。

由于经过以上7步只能制备成一种所需引物，所以二对能检测人巨细胞病毒DNA的引物需要分4次制备。