[发明专利]通过苗端转化植物的方法

说明书

这是1988年6月1日申请的201568号专利申请的部分连续申请。

本发明涉及一种转化植物的方法，转化后的植物具有高水平的快速再生能力及组织培养导致的低遗传变异率。具体地说，该方法采用苗组织、或完整植物腋芽的分离苗端作转化的目标组织，并用于植物的再生。

将遗传工程技术用于植物的主要障碍是不能由主要农作物的植物细胞培养体系进行常规的、可重复的再生。另外，据Larkin和Scowcroft，Theor.Appl.Genet.60，197（1981）报道。当离体随机地再生植物时存在体细胞克隆变异的倾向。体细胞克隆变异会导致根癌病土壤杆菌（A.tumefaciens）的介导基因传递，体细胞克隆变异是在来自愈伤组织的植物中观察到的遗传变异，保持转化植物原始遗传完整所必须的这种现象是不希望有的。

在用于基因传递的共培养体系中，根癌病土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）已成为叶片、表皮片或其它分离块的优选载体。用茄科的植物已研究了根癌病土壤杆菌，介导基因的传递，因为茄科植物在培养时容易操作，并且土壤杆菌属（Agrobacterium）菌种易浸染茄科植物。尽管已经知道许多双子叶植物种类是土壤杆菌（Agrobacterium）的合适宿主，但由于缺少再生体系，只有少量植物种类能成功地进行转化。

由Horsch等，Ann.Rev.Plant    Physiol.38，467（1987），研制的叶片转化体系可使大多数外源遗传物质常规转移，但只能导入有限种类的植物中。采用茄科植物：矮牵牛、烟草和蕃茄（它们比较容易由叶分离块物质再生）证实了这种典型的体系。叶片技术克服了原生质体转化体系中存在的许多问题，尤其是延长所需的培养周期，并限制从原生质体再生植物。

然而，该叶片体系是相当有限的，最主要的局限性是没有几种植物能从叶组织再生。甚至某些培养的矮牵牛变种也很难由叶片再生。叶片体系的另一个局限性是从表皮和表皮下叶组织随机地分化出苗分生组织。已研究叶片方法的改进技术，包括使用与体细胞胚胎发生的诱导相关的苗组织以及苗诱导后的愈伤组织。然而，在每一种技术中，由于胚胎和苗分生组织必须随机地发育，因此存在有体细胞克隆变异。

Trinh等，5    Biotechnology，1081（1987）已研究了另一种植物转化体系。该体系是使用烟草表皮体系，并与土壤杆菌（Agrobacterium）共培养。该体系的优点是八周内直接得到花和籽。然而，对该体系至关重要的是适用该技术的作物种类有限，由于通过不定的器官形成而产生植物，因此仍有体细胞克隆变异的倾向。

本发明采用上述技术，用苗端组织作为易进行基因转化的组织，解决了存在的障碍。使用这种组织可使植物快速繁殖，同时可保持被转化植物的独特克隆和遗传特性。在实施本发明时，苗分生组织最好包括苗尖培养和腋芽扩增。苗端是用于植物转化的最好的分离块，使用这种分离块，许多草本双子叶和单子叶植物能再生为整体植物。苗培养物还可直接并快速地发育成为有根植物。在实施本发明时，还能采用除苗端以外的其它非外来的组织如腋芽。

将本发明方法用于苗端时，在合适的培养基中培养从选择的植物上切下的苗端。切下苗端或培养数天后，将苗端暴露于合适的载体如根癌病土壤杆菌。接种过的苗端再培养数日，培养后将苗端转移到选择的培养基中从没有转化的植物组织中分离转化的植物组织。然后再选择转化组织，在生根培养基中重新培养。再在普通条件下培养生根后的植物。

该方法可使转化植物快速再生，如用矮牵牛做实验在六周内得到结果，由上述方法生成的植物已自体繁殖，得到的籽无苗地发芽。生成的苗其百分之九十具有新的插入基因、新遗传信息的证实性转递。

在实施本发明时，土壤杆菌属细菌是优选的，但也能使用能在植物中进行遗传转化的其它载体，包括其它细菌、质粒、病毒、和DNA片段。

图1表示转化植物的荧光GUS测试结果，该结果表明GUS活性期为5小时以上，用Kontron荧光分光计定量所产生的甲基繖形酮的量。结果表明用本发明方法可成功地使矮牵牛转化。

下述的讨论和实施例详述了实施本发明的最好方法，应该知道，该方法的变更可能包括根据目标植物种类和转递入目标植物的性状而采用不同的培养基或不同的载体。下列实施例中，选用矮牵牛、大豆、苜蓿、向日葵、棉花、小麦和玉米作目标植物。然而，下面简述的方法也可用于能从苗端或腋芽再生的其它植物，这无需实验证明或不会背离本发明的实质和范围。