[发明专利]兽用天花粉蛋白胶囊的生产方法

说明书

本发明属于以蛋白质为有效成份的药物生产方法。

胎衣不下是奶牛产科中发病率较高的一种疾病。胎衣不下往往导致子宫内膜炎或生殖系统的其它疾病，甚至造成不孕而使奶牛被迫淘汰，这是目前国内外养牛业普遍存在的难题之一。天花粉蛋白针剂用于人体抗早孕、中期妊娠引产和治疗有关妇科疾病有独特疗效。现经病理观察，证实天花粉蛋白也能促使奶牛的胎盘组织变性坏死，并能使胎盘比较完整和提早下落，促使子宫内环境提早净化，子宫机能得到迅速复旧。为此汪绍福等（中国兽医杂志13（4）38，1987）研制了兽用天花粉蛋白胶囊，基本上是按照制取人用天花粉蛋白老工艺方法。该法具有生产步骤长，冷冻体积大，设备利用率低，生产成本高等缺点，兽用药物量比人用的要大得多，故价格太贵，在畜牧业上显然没有实用价值。在潘新权等发表的（上海农学院学报3（2）99，1985）中提到将天花粉蛋白和50毫克、100毫克、200毫克装入胶囊作临床试验，该天花粉蛋白是由上海生物化学制药厂提供，也就是提供人体注射用的天花粉蛋白（粗制品），其中蛋白质含量仅40-50%（生产该品种的方法已淘汰），产品质量差。

本发明目的就是要寻找一条新的兽用天花粉蛋白胶囊的生产工艺路线，产品质量要满足要求，简化生产步骤，提高设备利用率，降低生产成本，适宜于大工业生产。

本发明兽用天花粉蛋白胶囊的生产方法是从葫芦科（Cucurbitaceae）栝楼属（Trichosanthes    Kirilowii    Maxim）植物的块根中提取出一种具有生理活性植物蛋白的方法，就是取新鲜天花粉原汁的0.7-1.2倍丙酮沉淀物，水溶，透析，离心，取其上清液，再用该液体积2倍以上的丙酮沉淀，取沉淀物，用适量水制成糊状，再冷冻干燥，装胶囊。

新鲜制得的天花粉原汁中含有多种蛋白质，其中一种是具有生理活性的有效成份，其它均为无效蛋白或低效蛋白，并有较大的毒性和抗原性（引起过敏反应的成份）。因此必须将天花粉原汁进行分离提纯，剔除无效或低效蛋白，提高有效蛋白的含量。天花粉蛋白加热后，其生理活性即消失，故提取天花粉蛋白的操作以保持在10℃以下进行为宜。天花粉有效蛋白的等电点为pH9.4，而无效的杂蛋白等电点为4左右，因此用4N盐酸把pH调至4，然后用丙酮分级沉淀，可使大部份杂蛋白接近等电点电而沉淀除去。本发明选择了恰当的溶剂体积比，简化了生产步骤，就是取原汁的0.7-1.2倍丙酮沉淀物，水溶后，用国产普通玻璃纸在流水中透析36-40小时，离心，沉淀弃去，取上清液。原来老工艺中就将该清液直接冷冻干燥，由于冷冻体积大，设备利用率低，生产成本高，大工业生产有困难。本发明采用溶剂沉淀和冷冻干燥相结合处理进行改进。将该清液测量体积，在搅拌下加入该清液体积2倍以上的丙酮使之沉淀，离心，上清液回收丙酮，所得沉淀是纯蛋白，易变成胶状物，为介决这一矛盾，可将此沉淀物用适量水制成糊状，再冷冻干燥，分装胶囊，即为成品。天花粉蛋白产物是比较松散的，每公斤新鲜天花粉生药可得2克左右天花粉蛋白。改进后可使冷冻体积缩小15倍左右，由此设备利用率也相应提高15倍左右，使生产成本大大降低。

本发明兽用天花粉蛋白胶囊生产简要工艺流程示意图如下：

本发明生产的天花粉蛋白为白色或微黄色粉末，有吸湿性，其有效成份为植物蛋白，由19种氨基酸所组成，分子量为25682，等电点为pH9.4，能溶于水和生理盐水，对pH试纸呈中性反应。蛋白质含量不低于70%，灰分在10%以下。毒性LD₅₀不小于10mg/kg。用琼脂加羧甲基纤维素电泳鉴定主要为一点。用聚丙烯酰胺凝胶园盘电泳鉴定尚有6-7条色带，但其有效蛋白含量很高，无效蛋白含量甚微。其琼脂糖免疫电泳有三条弧线，且主要为一条。这些电泳鉴定与老工艺法生产的产品鉴定相同，因此本发明生产的天花粉蛋白除去了大部分无效蛋白，使毒性降低，过敏成分减少，药品质量提高。药理试验证明，本发明生产的兽用天花粉蛋白比人体注射用的天花粉（粗制品）疗效提高四倍，而毒性仅相应提高2-3倍，表明前者的质量较后者的为高。临床试验对胎衣不下奶牛降低不孕率和提高受胎率也获得了较好的效果。

本发明兽用天花粉蛋白胶囊生产方法采用了新的生产工艺路线，使生产步骤简化，冷冻体积缩小15倍左右，设备利用率也相应提高15倍左右，生产成本大大降低，适用于工业生产，对降低养牛成本，加速奶牛发展，将发挥重大的经济效益和社会效益。

为了更好地理介本发明，现举例如下：

实施例

取新鲜采集的天花粉生药（栝楼根）50公斤，洗净，去皮，绞碎，压汁，静置过夜，去除沉淀，约得原汁12000毫升。将它置于30000毫升搪瓷桶中，用冰盐水冷却到5℃左右，以4N    HCl调节pH至4。在搅拌下缓慢地加入冷却过的丙酮8400毫升，在加丙酮过程中，温度上升较快，应注意控制在10℃以下。此时有大量沉淀产生，在0-8℃温度下离心20分种（1500转/分），弃去沉淀。上清液再加冷却过的丙酮6000毫升，又有大量沉淀产生，再离心15分钟。上清液回收丙酮，取沉淀物用800毫升水溶介后，用国产普通玻璃纸在流水中透析36-40小时。将透析液离心15分钟，弃去沉淀，测量清液体积。在搅拌下再加该清液体积2.5倍的冷却过的丙酮于清液中，产生沉淀，离心10分钟，上清液回收丙酮，沉淀物约用100毫升水制成浆糊状，冷冻干燥，得兽用天花粉蛋白约100克左右，分装成胶囊，每粒胶囊含天花粉蛋白150毫克，即为成品。