[发明专利]重组DNA产生的博德特氏菌毒素类似物

说明书

本发明提供了在大肠杆菌中高水平直接表达博德特氏菌外毒素的S1、S2、S3、S4和S5亚基重组类似物的方法，而不需与异源蛋白部分进行融合。更具体地说，通过基因工程对亚基进行修饰，提供了一类博德特氏菌毒素类似物，它们能诱发毒素中和水平的抗体，并且基本上不含有反应原组分。通过基因工程得到的亚基能够用来产生亚基疫苗，它们既具有免疫原效应，又基本上不含反应原组分。

名词“博德特氏菌外毒素”是指一组由博德特氏菌属不同组的基因组编码的毒素，例如百日咳博德特氏菌(Bordetella Prtussis)、副百日咳博德特氏菌(B·Parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(B·bronchiseptica)。通常用来指博德特氏菌外毒素的其它名词还有百日咳毒素(“PTX”)、淋巴细胞增多促进因子(“LPF”)和胰岛活化蛋白(“IAP”)。

在世界许多地区，百日咳仍然是婴儿发病和死亡的主要原因。百日咳博德特氏菌的完整细胞疫苗是控制此疾病的一种有效手段。但是，此疫苗的使用与温和的副作用直接相关，有时甚至于更为严重，偶而与致命的、神经性疾病相关。    

已经作出了广泛的努力，以试图消除已知与现行疫苗相关的有害副作用。这些努力导致了非细胞疫苗的生产和试验，在基础研究中，这些努力则导致了试图去生产更为安全的重组产物。为了克隆生产来自重组DNA的疫苗，关键性的第一步是测定百日咳毒素操纵子的顺序，从而推测出单个亚基的氨基酸顺序(Locht，C.和Keith，J.M.，1986，Science 232：1258-1264；Locht等人，1986，Nucl.Acids Res.14：3251-3261；Nicosia等人，1986，proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4631-4635)。

Nicosia等人(1987，Infect.Immun.55：963-967)证实，编码百日咳博德特氏菌S1、S2、S3、S4和S5中每一亚基的mRNA能够由大肠杆菌中的克隆基因高效率地转录。尽管他们意欲表明天然百日咳毒素多顺反子信息的高水平转录，但由直接表达产生的蛋白量仍然很低或难以测出。进一步，随后合成的融合蛋白不能诱发任何中和性或保护性免疫应答。

Barbieri等人(1987，Infect.Immun.，55：1321-1323)证实了S1亚基作为融合蛋白在大肠杆菌中的表达。此融合蛋白含有β-半乳糖苷酶的最前面6个氨基酸、由pUC18多人工接头编码的5个氨基酸，随后是S1亚基的氨基酸2至235号。以少量生产的S1融合蛋白，只具有真正的或天然百日咳毒素的大约25％的ADP-核糖基转移酶活性。    

Locht等人(Abstract，Modern Approaches to NewVaccines，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1986年9月9-14日)能够表达含有S1亚基2-187号氨基酸的融合蛋白。他们预测此构建物没有毒性，因为他们认为它没有与ADP-核糖基转移酶有关的NAD结合位点，而此酶的活性被认为是毒素反应原性的来源。但随后用此分子进行的实验表明，此截断分子所具有的酶活性基本上没有减少。在现有技术中已知的多个或单个亚基类似物中，没有一个能够诱发毒素中和水平的抗体，而又基本上不具有与反应原性相关的酶活性。

图1是PTX操纵子的顺反子顺序的概图(现有技术，见上面的Locht和Keith)。标有S1、S2、S4、S5和S3的区域代表对每种PTX亚基推测的可译框架。每个顺反子前的黑色区域代表推测的信号顺序。紧靠每个顺反子下游的限制性酶切位点标明了用于将该顺反子亚克隆入表达载体中的下游限制位点。位于每个信号顺序区之内的限制性酶切位点用来作为将完整顺反子亚克隆入表达载体中的上游限制位点，在亚克隆时，用合适的寡聚脱氧核苷酸人工接头使未成熟的PTX亚基的信号顺序完整无损。在刚好位于每个成熟的PTX亚基的可译框之内的限制性酶切位点，与合适的寡聚脱氧核苷酸人工接头一起，用作没有信号顺序的顺反子的亚克隆的上游限制位点，以产生甲硫氨酰—成熟PTX亚基。